分子生物学的手法を用いた胆道閉鎖症術後の肝内胆管再生機構の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23792025
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 田中 拡 東北大学, 大学病院, 助教 (50579448)
• Keywords: 胆道閉鎖症 / 胆管再生

Research Abstract

本研究では、胆管上皮細胞が障害を受けた際に、どのように肝芽細胞から胆管上皮細胞へ分化・増殖制御されているかということに着目している。さらに、そのメカニズムを明らかにすることで、胆道閉鎖症術後の肝内胆管の再生メカニズムを解明することを目的としている。
一方、転写因子C/EBPαによる胆管上皮細胞への分化抑制および肝細胞への分化誘導する詳細なメカニズムは、いまだ不明である。
本研究では、C/EBPαの下流にある因子を特定し、胆管上皮細胞への分化抑制、および肝細胞への分化誘導する詳細なメカニズムを解明することにより、胆道閉鎖症術後の肝内胆管の再生メカニズムを解明できると考えている。
まず、初年度から継続して肝芽細胞の分離精製を行っている。これは、肝芽細胞を用いた転写活性化因子C/EBPα標的下流遺伝子候補の検索をするためである。さらに、肝芽細胞にC/EBPαの発現を調整し、その後の細胞を回収し、マイクロアレイによって遺伝子の変化のあったものをピックアップすることにより、候補遺伝子を検索することを目的としている。現在まで、マウスの胎児肝を用いて、肝芽細胞特異的表面タンパク質モノクローナル抗体を用いてFACSで分離精製しようとしたが、FACSによる肝芽細胞の分離が不成功であった。肝芽細胞を用いた次のステップとして、ノックダウン実験を行う予定であったが、当該年度には行うことができなかった。
現在、継続して肝芽細胞の分離精製の条件検討を行っている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

昨年度までと同様に、マウスの胎児肝を用いて、肝芽細胞特異的表面タンパク質モノクローナル抗体を用いてFACSで分離精製しようとしたが、FACSによる肝芽細胞の分離精製がいまだできておらず、難渋している。

Strategy for Future Research Activity

FACSによる肝芽細胞のソーティングを行い、精製度の高い肝芽細胞を収集すること、またできる限り多くの細胞を採取する方法を構築していく。また、他の表面マーカーを変え精製していくことも考慮する。それができた場合には、肝芽細胞を用いたC/EBPαノックダウン細胞を作製するため、エレクトロポレーション法 (AMAXA)を用いて肝芽細胞にsiRNA導入実験を行い、導入効率等を検討していく。
もし、分離不能の場合には肝芽細胞の分化後である肝細胞株と胆管細胞株の作成を行い、それら細胞を代用して別方向から検索する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

マウスの胎児肝を用いて、肝芽細胞特異的表面タンパク質モノクローナル抗体を用いてFACSで分離精製しようとしたが、FACSによる肝芽細胞の分離精製がいまだできておらず、難渋している。つまり、実験が先に進めず、高額な試薬などを使用していないため。
FACSのための別の抗体の購入、精製ができない場合には細胞株を作成する。また、遺伝子導入のための試薬とsiRNAも購入する。