表皮角化細胞での細胞‐細胞接着と細胞‐細胞外マトリクス接着との動的相互作用の解明

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23792050
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 立石 千晴 大阪市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 後期研究医 (40597308)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2013-03-31
• Keywords: 細胞-細胞接着 / 細胞-細胞外マトリクス接着 / live cell imaging / ヘミデスモゾーム

Research Abstract

我々は、表皮角化細胞における細胞-細胞外マトリクス接着と細胞-細胞接着の動的相互作用について検討することを研究目的として実験を行う。具体的には、細胞-細胞接着であるデスモゾームおよびアドヘレンス結合を阻害する条件下（天疱瘡患者血清下、構成タンパクsiRNA下、細胞骨格阻害剤下）で、細胞-細胞外マトリクス接着である接着斑(Focal contact:FC)およびヘミデスモゾーム構成タンパクのダイナミクスが、どのように変化するかを共焦点レーザー顕微鏡下にLive cell imaging methodsを用いて観察することを目的とする。今年度、細胞-細胞外マトリクス接着を視標とするためにヒト正常表皮角化細胞（NHEK)細胞に接着斑の構成タンパクであるαアクチニン（CFP）プラスミドとヘミデスモゾームの構成タンパクであるβ4 integrin(YFP)プラスミドをdual transfectionを行い、Live cell imagingが行えることを確認した。次に、NHEK細胞がconfluentの状態でもLive cell imagingが可能かどうかを検討し、両者の局在がsubconfluentの状態とは変化するが、観察可能であることが確認できた。　同時に、NHEK細胞がconfluentな状態に於いて細胞-細胞接着の状態を免疫染色を行い観察した。細胞-細胞接着の確認の後、細胞-細胞接着阻害剤（コナヒョウヒダニ抗原）を投与したが、細胞-細胞接着の状態に変化が見られなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Live cell imagingの最も重要である目的タンパクの細胞へのtransfectionの成功と、観察が出来たことは満足する結果である。また、dual transfectionが成功し、観察できたことも良い結果である。しかし、細胞-細胞接着の阻害条件での観察がまだ不十分であるので、今後の検討課題である。阻害条件が確定できれば、その条件下でlive cell imagingが行えれば、細胞-細胞外マトリクス接着と細胞-細胞接着の動的相互作用について検討することができると考えている。

Strategy for Future Research Activity

本年度、決定出来なかった細胞-細胞接着の阻害条件を決定することと、siRNAを用いたknockdown条件を決定する。この条件下と正常条件下でのdynamicsを検討することを目的とする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

本研究は、NHEKの培養条件なども結果の精度を左右する大きな要因となっている。しかし、申請者１人で細胞培養、遺伝子導入、観察実験を同時に行うことは時間的制約がありなかなか思うように実験が進まない。そのため、本年度は、実験補助員を雇うことも検討している。また、引き続きNHEK細胞の購入、培養、siRNAの購入などに研究費を使用して行くことを考えている。