人工バイオ微小環境を利用した癌細胞転移能の動的評価系の開発

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23792151
• Research Institution: Tokyo Dental College
• Principal Investigator: 國分 克寿 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (90535808)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: EpCAM / 循環癌細胞 / ファージディスプレイ

Research Abstract

上皮性細胞接着分子（EpCAM）は細胞表面に局在する糖タンパク質で、循環癌細胞（CTC）のマーカータンパク質として利用されており、最近の研究では、EpCAM 抗体を用いたCTC分離デバイスの開発が報告されている。本研究では、抗体をマーカータンパク質に結合する人工ペプチドに置き換えることで、捕捉した細胞を生体内に近いインタクトな状態で回収し、その機能解析が可能になると考えた。まず始めに、がん研究所の柏木らにより取得されたEpCAM結合ペプチドEp301の結合能の評価を行った。EpCAMタンパク質への結合能の評価を１分子蛍光分析システムを用いて行った結果、Ep301とEpCAMタンパクとの結合は認められなかった。また、EpCAM発現細胞株であるMCF-7やEpCAMトランスフェクト細胞へのEp301の結合評価においては、コントロールのペプチド非提示ファージと比較し、差はわずかにしか認められなかった。そこで次に、より強い結合能をもつペプチドを取得するため、Ep301におけるAlaスキャニングで相互作用に重要とされた４つのアミノ酸を保存した12残基のランダムペプチド提示ファージライブラリーを新たに作製した。作製したライブラリーにEpCAMタンパク質を結合させ、結合の弱いファージは洗い流し、結合能の強いファージを濃縮した。この一連の操作を５回繰り返し（バイオパニング）、得られたファージをクローン化してDNA配列解析を行うことでランダム領域に提示されたアミノ酸配列を同定した。その結果、新たにクローン化した#114ファージはEp301と比較し、EpCAMタンパク質に15倍の結合能をもつことが分かった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

用いる予定であったEp301の結合能が低く、新たにファージライブラリーを作製し、結合ペプチドを取得するという行程が入ってしまったため、遅れが生じてしまった。またファージライブラリーの作製も、実験計画よりも日数がかかってしまった。

Strategy for Future Research Activity

平成23年度に取得した#114の結合能ならびに特異性の評価を行う。また、#114取得の際、他のクローンにも共通してみられるアミノ酸残基が９個認められたため、それら９個を保存したサブライブラリーを作製し、より結合能の強いペプチド取得にも取り組んでいく。EpCAMタンパク質との結合に関しては、１分子蛍光分析システムやSPRを用いて定量的に評価を行っていく。また、EpCAM発現細胞株やEpCAMノックダウン細胞、EpCAMトランスフェクト細胞を用いて、EpCAM結合ペプチドのEpCAM発現細胞への結合能の評価を行っていく。結合が評価されたペプチドに関してはデバイス上にコートし、センサーとしての評価も行っていく予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

試薬や器具、その他の消耗品が使用の中心となる。また、ペプチド合成に関しては、外部委託を基本とするが、DNA合成と異なり、比較的高価であることを申し述べておきたい。