イネ縞葉枯ウイルス逆遺伝学実験系の開発と利用

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23880032
• Research Institution: National Institute of Agrobiological Sciences
• Principal Investigator: 石橋 和大 独立行政法人農業生物資源研究所, 植物・微生物間相互作用研究ユニット, 任期付研究員 (20611742)
• Keywords: イネ縞葉枯ウイルス / 植物病理学 / マイナス鎖RNAウイルス / RNAポリメラーゼ

Research Abstract

植物のマイナス鎖RNAウイルスは遺伝子操作ができないため,増殖過程の分子機構には不明な点が多い.本研究は,イネ縞葉枯ウイルス(RSV)の粒子を再構築することにより,遺伝子操作実験系の確立を目指すものである.そこで,本年度はRSV粒子の構成成分であるヌクレオキャプシドタンパク質およびRNAポリメラーゼの合成を行った。
ヌクレオキャプシドタンパク質は大腸菌を用いて合成することができた.精製タンパク質標品はそのままではRNA結合能を示さなかったが,ヌクレアーゼ処理およびヌクレアーゼの不活化を行うとRSVゲノムRNAとの結合が観察された.このことから,大腸菌において発現させたヌクレオキャプシドタンパク質は大腸菌由来のRNAと結合した状態で精製されたと考えられた.
一方RNAポリメラーゼ遺伝子は大腸菌体内で不安定であり,かつ毒性を示すためクローニングが困難であったが,大腸菌株を選択することによりクローニングに成功した.RNAポリメラーゼはN.benthamiana葉におけるアグロインフィルトレーション法や小麦胚芽抽出液を用いた試験管内翻訳では発現が認められなかったが,タバコBY-2脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いた試験管内翻訳によって発現させることができた.しかしながら,現在の所RNAポリメラーゼ活性は確認できていない.次年度は活性を有するRNAポリメラーゼを得るための発現・精製・反応条件を検討する予定である.
植物細胞内でのRSV粒子再構築も計画していたが,これはRNAポリメラーゼの発現が認められなかったため中断した.

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

330kDaと非常に大きく,発現に困難が予想されたRSV RNAポリメラーゼについて,クローニングおよび発現に成功した。目的の達成にむけてはまだいくつかの困難が残されているものの,最初の難関を突破できたと考えられる。次年度の飛躍に期待がもてる研究成果となった.

Strategy for Future Research Activity

現在RNAポリメラーゼ活性が検出できていない原因として,そもそも合成したタンパク質が正常な構造をとれていない可能性と,RNAポリメラーゼを活性化する未知の機構が存在する可能性が考えられる。これらの可能性を考慮しつつ,活性をもつRNAポリメラーゼを得るために,数多くの発現・精製・反応条件を検討することが最も有効な推進策と考える.