2024 Fiscal Year Research-status Report

The role of DNA methylation in epigenetic barrier between naive and primed state

Research Project

Project/Area Number	23K05607
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	浦大樹金沢医科大学, 総合医学研究所, 講師 (90624958)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Keywords	エピジェネティクス / 細胞分化 / 幹細胞 / DNAメチル化 / 発生
Outline of Annual Research Achievements	全能性を持つ受精卵は、発生過程において分化能が制限され、それぞれの細胞が特定の細胞に分化することで個体を形成する。しかしながら持っている遺伝情報は変わることはないことから、後天的な制御であるエピジェネティックな制御(エピジェネティックバリアー)により、特定の遺伝子群の発現を制御することによって分化能を制限し、正常に発生しているといったエピジェネティックランドスケープが提唱されているが、実体は明らかとなっていない。マウス多能性幹細胞には、着床前胚から樹立されたESCと着床後から樹立されたより分化の進んだEpiSCが知られている。樹立された発生時期の違いから、ESCは胎盤の元となる胚体外内胚葉(XEN)に分化できるのに対し、EpiSCはXENには分化できないことが知られている。エピジェネティックバリアーにより分化運命が決定されており、EpiSCではXENへの分化を制御する遺伝子群が抑制されていると考えられる。抑制性エピジェネティック修飾の１つであるDNAメチル化が着床後、さらにはESCに比べEpiSCで劇的に増加しているため、DNAメチル化がXENへの分化を抑制するエピジェネティックバリアーと仮定した。そこで３つのDNAメチル化酵素(Dnmt)遺伝子を破壊し、DNAメチル化能が完全に欠損したDnmtトリプルノックアウト(TKO) ESCからEpiSCを樹立し、XEN分化誘導システムにより、DNAメチル化が入っていないTKO EpiSCがXENに分化可能かを検討することで、エピジェネティックバリアーの実体がDNAメチル化であるか否かを明らかとすることを目的としている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason エピジェネティックバリアーの実体がDNAメチル化であるか否かを明らかとするため、DNAメチル化が完全に欠損したDnmt1/3a/3b (TKO) ESCからEpiSCの樹立を行った。野生型のEpiSCはESCと異なり胚体外内胚葉(XEN)への分化はエピジェネティックバリアーにより抑制されていること示唆されている。そこで本研究で仮定したエピジェネティックバリアーであるDNAメチル化を完全に欠損したTKO EpiSCをXENへ分化させることでXENへの分化能を検証する。Dnmt1/3a/3b (TKO) EpiSCに分化誘導転写因子であるGata6とグルココルチコイド受容体との融合タンパク質を発現するベクターを導入し、安定的にXENへの分化を誘導できるXEN分化誘導システムを持ったTKO EpiSCを作成し、XENへの分化能を検証した。TKO EpiSCでは野生型EpiSCとは異なり、XENに分化したことが形態的に示唆されている。網羅的発現解析の結果から、TKO EpiSCは野生型ESCと同様にXENへ分化した発現パターンを示した。これらの結果により、TKO EpiSCが樹立されていることが示されたのでおおむね順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	野生型のESCとEpiSCを分化させてESCではXENに分化すること、EpiSCはXENには分化できずに内胚葉に分化することを形態解析や網羅的発現解析により確認している。Gata6のChIP-Seq解析により、ESCとEpiSCで分化させた細胞(XENと内胚葉)における結合パターンが異なることも確認する予定である。TKO EpiSCをXEN分化誘導システムにより、分化させてXENに分化しているかどうかを形態解析やRNA-Seqによる網羅的発現解析、さらにGata6のChIP-Seq解析により、野生型のESCとEpiSCで分化させた細胞(XENと内胚葉)と比較しどの部位のメチル化が分化を制御しているかを検証する。
Causes of Carryover	当初の予定では今年度にエピジェネティックバリアーの実体がDNAメチル化であることを証明するために分化能を調べるために仮定したエピジェネティックバリアーであるDNAメチル化を完全に欠損したTKO EpiSCをXENへ分化させることでXENへの分化能を検証する予定であった。Dnmt1/3a/3b (TKO) EpiSCに分化誘導転写因子であるGata6とグルココルチコイド受容体との融合タンパク質を発現するベクターを導入したところまで進んでいるが、網羅的発現解析やクロマチン免疫沈降法(ChIP-Seq)による多能性転写因子であるGata6の結合部位の解析による分化能を検証が必要である。このため、次年度には分化能を検証するための細胞培養試薬、網羅的発現解析やChIP-Seq解析に必要な次世代シークエンサー試薬や分子生物学実験試薬が必要となるため。