2023 Fiscal Year Research-status Report
Functional and structural analysis of proline dehydrogenase for elucidation of proline biosynthesis in hyperthermophilic archaea
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23K05658
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
櫻庭 春彦 香川大学, 農学部, 教授 (90205823)
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2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | L-プロリン脱水素酵素 / NADH脱水素酵素 / X線結晶構造解析 / L-1-ピロリン-5-カルボン酸レダクターゼ / L-プロリン生合成 / 超好熱アーキア / フラビン酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
超好熱アーキアにおけるフラビン酵素探索の過程で、ヘテロ4量体型L-プロリン（L-Pro）脱水素酵素を発見し、その機能解析を進めてきた。この酵素は、4種類のサブユニットα、β、γ、δ から成る複合体構造を取るが、βサブユニット単独でL-ProをL-1-ピロリン-5-カルボン酸（P5C）に変換するL-Pro脱水素酵素活性を示し、αサブユニット単独ではNADHをNADに変換するNADH脱水素酵素活性を示す。通常、L-Pro脱水素酵素はL-Proからのエネルギー生産に機能すると考えられるが、なぜNADH脱水素酵素と複合体を形成するのか謎であった。すでに我々は、Thermococcus profundus由来の本酵素複合体（TPPDH）がNADHの減少に伴い、L-Proを合成するP5Cレダクターゼ活性を持つことを見出し、L-Proの生合成に関与する可能性が示唆された。本研究では、この複合体の機能・構造相関を解析することを目的とした。
βサブユニットのN末端にヒスチジンタグを付加した酵素を精製し、精製酵素の結晶化条件のスクリーニングを行った。10 mg/mlの酵素濃度では、結晶が得られなかったが、50 mg/mlの高濃度で仕込むと酢酸マグネシウム・カコジル酸バッファー・PEG6000の条件で結晶化に成功した。高エネルギー加速器研究機構において、X線回折実験を行い、3.4 Åの分解能でデータを収集した。現在、位相決定を進めている。また、さらに高分解能の反射を示す結晶の作成に取り組んでいる。一方、βサブユニット単独の結晶化に2-プロパノール・クエン酸バッファー・PEG1000の条件で成功した。X線回折実験の結果、1.2 Åの高分解能データを収集し、分子置換により位相決定を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①TPPDH複合体について結晶化に成功し、3.4 Åの分解能でデータを取得している。
②TPPDHのβサブユニット単独の結晶化に成功し、1.2 Åの分解能でデータを取得している。また、分子置換により位相決定に成功した。
③T. profundus近縁種のαβγδ型L-Pro脱水素酵素複合体について、大腸菌における大量生産系（βサブユニットヒスチジンタグ有り）が構築できており、酵素の精製法を確立している。また、これらがP5Cレダクターゼ活性を持つことを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
①TPPDH複合体について、3.4 Åの分解能データの解析を進める。分子置換で位相が決定できない場合、セレノメチオニンを含む酵素を調製し、セレンの異常分散（Se-MAD法）による位相決定を試みる。また、さらに高分解能の反射を示す結晶の作成を進める。
②TPPDHのβサブユニットについて、モデル構築を行い、結晶構造を決定する。すでに構造解析に成功しているα4β4型L-Pro脱水素酵素のβサブユニットと構造比較を行う。
③近縁種のT. peptonophilusおよびPyrococcus horikoshii由来のαβγδ型L-Pro脱水素酵素複合体について精製方法を確立し、両者ともにP5Cレダクターゼ活性を持つことを確認したので、これらの酵素についても結晶化を進める。
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Research Products
(9 results)
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[Presentation] Two different alanine dehydrogenases from Geobacillus kaustophilus: Their biochemical characteristics and differential expression in vegetative cells and spores2023
Author(s)
Ohshima, T., Maeno, M., Ohmori, T., Nukada, D., Sakuraba, H., Satomura, T.
Organizer
International Workshop on Neotechnologies for ThermusQ initiative
Int'l Joint Research
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