2023 Fiscal Year Research-status Report
Novel DNA methylation mechanism mediated by pericentromeric non-coding RNA in mammals
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23K05728
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
鵜木 元香 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (30525374)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤本 明洋 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (30525853)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | DNAメチル化 / DNMT3B / セントロメア / ペリセントロメア / 非コードRNA / ICF症候群 / MLID |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、DNMT3Bが（ペリ）セントロメア反復配列由来の非コードRNAと相互作用する可能性があるかを検討した。正常人と1型ICF症候群患者由来のB細胞株を用いたDNMT3Bの公開RIP-seqデータ（Gatto et al, 2017）を入手し、データの再解析を行った結果、患者由来株においてDNMT3Bとの結合が増加したRNAの中に、複数のセントロメア反復配列（CER）が含まれていた。これは、当該領域の低メチル化に伴う転写の増加を反映しているものと考えられる。DNMT3Bと結合していたCERは76 bpから83 bpで多くの多型を含んでいたが、コンピューターシミュレーションにより、どのCERもmiRNA様の高次構造をとることが予測された。よってDNMT3Bは（ペリ）セントロメア反復配列由来RNAの一次配列もしくは高次構造を認識し、de novo DNAメチル化酵素活性で、当該領域をメチル化する可能性がある。今回検出されたRNAが高次構造をとり、DicerにプロセシングされてsiRNAとなり、DNMT3BがDicerとの相互作用を介してsiRNAを認識する可能性も考えられたため（Dicerは主に細胞質で機能するが、一部核にも局在するため）、DNMT3BとDicerの相互作用を免疫沈降にて調べたが、DNMT3BはDicerと共沈してこなかった。なお、DNMT1及びUHRF1もDicerと共沈してこなかった。また本研究費の一部で、細胞質に局在する蛋白質の異常が低メチル化を引き起こすMLIDという先天性疾患の分子病態機構の解明も行い、全く新しいDNAメチル化機構の一部を明らかにすることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ペリセントロメア・セントロメア反復配列から転写されたサテライトRNAとDNMT3Bが結合する可能性がRIP-seq dataから示唆され、その結合の生物学的意義の証明に向けた準備が整いつつあるため。また、非コードRNAを介してではないが、細胞質タンパク質が関与するDNAメチル化機構という全く新しいDNAメチル化の維持機構を明らかにすることができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
ビオチン化サテライトRNAをin vitro合成し、DNMT3Bとの結合をEMSAなどにより検討する。またどのような高次構造をとると、サテライトRNAとの結合が促進されるのかなども併せて検討する。また、DNMT3BがサテライトRNAと結合するタンパク質領域を、DNMT3Bのdeletion mutantを作って検討する。サテライトRNAとの結合領域が決定できたら、その領域を変異させたDNMT3Bを発現する細胞株を樹立し、サテライトRNAとの相互作用が当該領域のメチル化維持に必要かどうかを、バイサルファイトシークエンスなどで検討する。
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