2023 Fiscal Year Research-status Report
カスパーゼ反応場に選択的な非細胞死性の基質の包括的探索
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23K05747
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
篠田 夏樹 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (30838397)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | カスパーゼ / カスパーゼ基質 / 非細胞死性の機能 / 近接依存性標識法 / TurboID / ショウジョウバエ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの自身の近接依存性標識法TurboIDを用いた研究から,「カスパーゼは反応場を形成することで非細胞死性の活性化及び機能の発揮を可能とする」との作業仮説を構築していた. 本研究ではカスパーゼが成す反応場の要素及び非細胞死性の機能の発揮を介在する選択的基質を同定することを目指している. 2023年度は, ショウジョウバエ実行カスパーゼDcp-1とDriceそれぞれのカスパーゼに嗜好性高く近接するタンパク質リストの中に, 自身がショウジョウバエにおける新規カスパーゼ基質であると同定していたBubR1が存在することを見出した. 具体的には, BubR1はDriceに近接していた. そこで, BubR1がDriceによって切断されやすい可能性を検討した. 具体的には, ショウジョウバエ培養細胞であるS2細胞にBubR1を発現し, 同時にDcp-1, Driceのそれぞれをノックダウンすることで, どちらのカスパーゼによって切断されやすいかを検討した. その結果, BubR1はたしかにDriceによって切断されやすいことを見出した. 以上の結果は, 反応場において近接タンパク質は非細胞死性に切断されやすい可能性を支持する. 以上の結果を, これまでに得ていたBubR1切断不全変異体ショウジョウバエ系統の表現型解析結果とまとめ, The FEBS Journal誌に論文を発表した.
以上の結果から, 近接タンパク質リストにはそれぞれのカスパーゼに嗜好性高く切断される基質がたしかに存在する可能性が支持された. そこで, 引き続き得られたリストの中から, カスパーゼの基質の探索を行った. 具体的には, S2細胞に近接タンパク質を発現し, アポトーシスを誘導することでカスパーゼによる切断可能性を検討した. しかし, これまでに検討したタンパク質については, 新規基質を発見できなかった.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2023年度では, 自身がショウジョウバエにおける新規カスパーゼ基質であると同定していたBubR1の, カスパーゼ近接タンパク質としての性質の解析を通して, 反応場において近接タンパク質は非細胞死性に切断されやすい可能性を支持する結果を得られた. また, これまでに得ていた結果も含めてその成果を論文として発表することができた (DOI: 10.1111/febs.16811). 一方で, 得られたリストの中から, これまでに検討したタンパク質については, 新規基質を発見できなかった. 以上の結果を総合し, 本研究課題はおおむね順調に進展していると評価した.
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度の結果から, 近接タンパク質リストにはそれぞれのカスパーゼによって嗜好性高く切断される基質がたしかに存在する可能性が支持された. また, ショウジョウバエ培養細胞であるS2細胞においてDcp-1, Driceのそれぞれをノックダウンすることで, どちらのカスパーゼによって切断されやすいかを簡便に検討する実験系の構築にも成功した. そこで, 引き続き得られたリストの中から, カスパーゼの基質の探索をより範囲を拡張して実施する. 基質を同定した場合は, 構築した実験系を用いてどちらのカスパーゼによって切断されやすいかを評価する. 並行して, 既に構築した切断嗜好性を簡便に評価する実験系を応用し, 当初の研究計画で計画していたSubtiligase-MSを実施することで, カスパーゼ基質のリストを得る. 近接タンパク質リストと基質のリストを照らし合わせ, それぞれのカスパーゼによって嗜好性の高く切断される基質の包括的な同定を目指す.
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| Causes of Carryover |
2023年度は質量分析によって既に得られていたタンパク質リストに関する実験に注力した. そのため, 当初Subtiligase-MS解析を行う予定で計上していた一部研究費の使用が抑えられた. 発生した次年度使用額は, Subtiligase-MS解析によってカスパーゼ基質リストを得るための費用として計上する.
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