2023 Fiscal Year Research-status Report
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23K05939
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
小糸 智子 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (10583148)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福島 英登 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (60466307)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 多毛類 / ハナオレウミケムシ / 水中曝露 / 餌曝露 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
環境中からのマイクロプラスチック(MP)の取り込み経路を明らかにする目的で、ハナオレウミケムシの水中曝露実験を実施した。人工海水に蛍光ビーズ（粒径１μm）を添加し、８時間まで曝露した。蛍光ビーズの濃度は1.0x10の4乗および1.0x10の8乗particle/mlとした。0.5、１、４、8時間でサンプリングし、固定した。マイクロプレートリーダー測定用サンプルは腸管とその他組織に解剖し、KOH溶液で溶解して測定に供した。グルタルアルデヒド固定サンプルは樹脂への包埋、薄切を行ない蛍光顕微鏡で蛍光ビーズの局在を観察した。その結果、1.0x10の４乗に曝露しても顕著な付着や取り込みは観察されなかった。一方、1.0ｘ10の８乗曝露では、頭部へ集中し、その後消化管へ取り込まれることがわかった。マイクロプレートリーダーで測定した結果、1.0ｘ10の４乗曝露は腸管、その他組織いずれも3.0ｘ10の7乗particle/g程度で推移した。1.0ｘ10の８乗曝露は4時間後に腸管での取り込み量が最大となったが減少し、8時間後にはその他組織の検出量が腸管を上回った。
摂食によるMPの取り込み経路を明らかにする目的で、ハナオレウミケムシに対して蛍光ビーズを混合した餌を与え、経時的な蛍光ビーズの挙動を調べた。８時間まで断続的に摂食させ、0.5、１、4、6時間でサンプリングし、水中曝露と同様の観察・分析を実施した。組織観察の結果、0.5時間からすり身中の蛍光ビーズが観察され、６時間後まで局在の変化は見られなかった。マイクロプレートリーダーを用いた定量では、4時間で取り込み量が最大となり、その後６時間までに減少した。
ハナオレウミケムシの水中および餌曝露により、いずれの条件でも蛍光ビーズは4時間までに取り込まれることが明らかとなった。また、経口摂取が主な取り込み経路であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
取り込み経路を調べるために必要な予備実験を概ね遂行できた。本研究で設定した曝露濃度および時間に基づき、次年度も曝露実験を継続する予定である。しかしながら、マイクロプレートリーダーを用いた蛍光ビーズの定量方法は改善する必要がある。まず、蛍光ビーズ単体の溶液は問題なく測定できるが、生物の組織片と混合すると蛍光強度が強く検出されてしまう。これは自家蛍光などの要因によるものであると考えられる。そこで組織片を除去するために濾過を行なったが、蛍光ビーズも濾紙にトラップされてしまい、無濾過のサンプルに比べ蛍光強度が著しく減少した。次年度は溶解方法、溶解時間について再検討を行ない、濾過を経ずにマイクロプレートリーダーで蛍光を測定する方法の確立を目指す。曝露実験は、水中曝露については予備実験として概ね良好な結果が得られた。一方、餌曝露についてはいくつかの課題が生じた。まず、餌曝露は絶食状態の複数個体に対してイカすり身を3g与えたが、摂餌する個体としない個体が存在した。すなわち、１個体あたりの摂餌量をコントロールすることが困難ということである。また、６時間までの曝露ではイカすり身の状態で腸管内に蛍光ビーズが留まっており、消化の様子を観察できなかった。さらに、前述のとおりマイクロプレートリーダーによる蛍光強度測定では水中曝露個体よりも蛍光強度の誤差が大きかった。それは、腸管溶解時に腸管内のイカすり身も含まれていることで、ハナオレウミケムシのみを溶解する水中曝露に比べ、溶解液の濁度がより高まったことが原因と考えられる。以上のことから、曝露実験の条件設定は継続可能であるが、分析方法については精度を高めるための改善が必要な状態である。
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| Strategy for Future Research Activity |
水中曝露および餌曝露実験を実施する。予備実験により4時間までに相当量が取り込まれることが明らかになった。しかしながら、消化管内へ取り込まれた蛍光ビーズがその後完全に排泄されるのか、いずれかの組織・器官に取り込まれるかを明らかにすることはできなかった。したがって、4時間までに水中および餌を介して取り込ませたのち、人工海水のみでハナオレウミケムシの飼育を継続し、経時的にサンプリングする。これにより、一度消化管に取り込まれた蛍光ビーズの動態を明らかにする。
予備実験では、蛍光ビーズの粒径を1.0μmに統一して曝露した。これは、深海性多毛類の腸管内から検出された顆粒の直径を基準としたためである。予備実験の組織観察では、水中曝露により取り込まれた蛍光ビーズが8時間後には腸上皮付近に存在することが確認されている。一方、粒子サイズによって組織内への取り込みの可否が存在する可能性があるため、粒径0.5μmの蛍光ビーズも用いて曝露実験を行ない、粒子サイズによって取り込みに違いがあるのかを確認する。
ハナオレウミケムシが取り込んだ蛍光マイクロビーズの挙動について、組織観察、マイクロプレートリーダーによる定量を実施した。両手法を総括すると、データの整合性はあるものの定量性には欠ける。したがって、マイクロプレートリーダーによる測定の精度を高めることに加え、異なる評価方法の追加を検討している。具体的には、組織切片もしくはハナオレウミケムシの組織溶解液を濾過した濾紙の画像解析により、蛍光ビーズの面積を求め、相対的な蛍光ビーズの多寡を評価する方法である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は、サンプリングが計画通り遂行できなかったためである。当初計画では、浅海性無脊椎動物体内のマイクロプラスチック分析のため、沿岸に生息する浅海性多毛類の採集を予定していた。その一方、本年度はマイクロプラスチック分析の実験系を確立する時期でもあり、当初予定以上にガラス器具などの器具を購入する必要があった。加えて、器具の破損等により、再度購入しなければならない事態が相次いだ。また、オープンアクセスジャーナルへ投稿し、受理されたものの、円高により想定以上の金額を支払うこととなった。これらの事情から、本来であれば甚大なプラスチック汚染が報告されている愛知県へ出張し、多毛類のサンプリングを予定していたが、そのための旅費および実験補助者の旅費を捻出することが困難となった。
次年度は、本年度確立した実験系を継続するため、新規で機器や器具を購入することが減るが、実験系の改良に向けて新たな試薬等を購入する。また、蛍光ビーズ等の消耗品も引き続き購入が必要であるため、それらも購入する。そして、多毛類のサンプリングのために申請者および実験補助者の旅費として使用する予定である。
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Research Products
(1 results)
