2023 Fiscal Year Research-status Report
Development of artificial lectin recognizing the optional target ganglioside by combining experimental and computational science
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23K06190
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| Research Institution | Nagasaki International University |
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Principal Investigator |
藤井 佑樹 長崎国際大学, 薬学部, 准教授 (80610063)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小関 準 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域 細胞分子工学研究部門, 主任研究員 (20616669)
大関 泰裕 横浜市立大学, 理学部, 教授 (70275022)
鎌田 健一 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 共同研究員 (80936568)
J・R・H Tame 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (00336588)
川嵜 達也 長崎国際大学, 薬学部, 講師 (70722073)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Keywords | 人工レクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちはこれまでにがん糖鎖Gb3に結合する天然レクチンを改変した人工レクチン、ミツバ-1の作製に成功している。レクチンの糖鎖結合能を保持しつつ、タンパク質の構造安定性の向上を目的に8000種類のβ-トレフォイル構造を計算科学で比較することで対称性に優れたタンパク骨格を見出すことに成功した。ミツバ-1はそれを骨格とすることで、糖鎖結合能を保持しつつ、室温でも長期保存が可能となった。本研究ではタンパク質の安定性の向上に加え、糖鎖結合能を改変する技術を確立することを目的として研究を計画した。
ミツバ-1を出発物質として、計算科学と分子軌道計算により、シアル酸に結合する新規人工レクチンを数種類デザインした。そのうち、人工レクチンCC-5 はシアル酸との相互作用が最も安定であることが計算科学により、推測された。これはCC-5の糖鎖認識部位にトリプトファンやヒスチジンを導入することで、シアル酸の相互作用を安定させていることが考えられる。CC-5の配列を挿入したプラスミドベクターを作製し形質転換を行うと、目的タンパク質CC-5は大腸菌1L培養あたり、1 mgのタンパク質発現に成功した。
精製CC-5を蛍光標識し、50種類の糖鎖が固定されたチップに加え、糖鎖結合能を解析した。その結果、ガラクトース結合能を消失したものの、シアル酸への結合は見られなかった。これは設計したCC-5は糖鎖の末端にあるシアル酸ではなく、単糖のシアル酸を認識していることが推察される。設計したレクチンはシアル酸含有糖鎖を認識しなかったものの、立体構造を保持しつつ、ある程度のタンパク量を発現することが可能な系の確立には至った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
設多くのβ-トレフォイル構造は二量体を形成し安定性を保っている。しかし、β-トレフォイル型タンパク質を単量体化すると不溶化が度々起こることが知られる。設計したCC-5は単量体のβ-トレフォイル型タンパク質でありながら、立体構造を保持しながら、十分量のタンパク質発現を行うことが出来た。同時に当該年度、検討されたタンパク質発現条件は今後の人工レクチンの開発に役立てることができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、分子動力学法と量子化学法を用いて、新たにシアル酸含有糖鎖を認識する人工レクチンの設計を行っていく。目的の糖鎖に結合する人工レクチンをより高い可能性で得られるように昨年度より、多い複数の配列をデザインし発現に取り組んでいくと共に安定してmgレベルのタンパク質を得られるような発現系を確立していく。設計・発現の進行度が順調である場合は分子ドッキング法によりSiaα2-3やSiaα2-6を識別できる人工レクチンも開発していくことも検討する。発現した人工レクチンが設計通りの立体構造を保持しているかを、X線結晶構造解析、円偏光二色性(CD)スペクトルにより解析していく。
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| Causes of Carryover |
研究費の効率的な使用を努めるために、現有の試薬や設備を活用することでタンパク質の設計、発現、糖鎖結合能の解析を行ってきた。設計した人工レクチンは発現に成功したものの、糖鎖結合能に関してはその機能を向上させる余地があった。このため、次年度以降の研究を加速させるために未使用額はその経費に充てることを計画した。
上記の研究計画で示した通り、次年度以降では糖鎖結合能の精度やタンパクの安定性を向上させた人工レクチンの設計・作製を行っていく。タンパク質発現や精製に必要な生化学・分子生物学に関連した試薬の購入に充てる。加えて、シアル酸含有糖鎖を認識する人工レクチンの細胞に与える影響を調べるために細胞に関連した試薬の購入も予定している。さらにこれらの成果発表のための学会参加のための旅費や論文投稿料に活用していくことを考えている。
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[Presentation] Discovery of the first R-type lectin from Mytilidae (sea mussels) and its cellular function2023
Author(s)
Yuki Fujii, Jun Koseki, Kenichi Kamata, Marco Gerdol, Hijiri Hirashima, Kyohei Noda, Kosei Fujihara, Ryuhei Hayashi, Ryuya Ishiwata, Suzuna Yoshimoto, Mayuka Ohkawa, Masamitsu Konno, Masao Yamada, Yukiko Ogawa, Hideaki Fujita, Jeremy Tame, Yasuhiro Ozeki
Organizer
Glyco26(2023, Taipei, Taiwan)
Int'l Joint Research
