2023 Fiscal Year Research-status Report

脳・脊髄液以外の検体からの微量異常型プリオン蛋白検出法の開発

Research Project

Project/Area Number	23K06946
Research Institution	University of Miyazaki
Principal Investigator	森剛志宮崎大学, 医学部, 助教 (40426565)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	佐藤克也長崎大学, 医歯薬学総合研究科(保健学科), 教授 (70398147)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Keywords	プリオン病 / QUIC法
Outline of Annual Research Achievements	プリオン病は伝播性を有する致死性の感染性神経変性疾患であるが、現時点において有効な治療法や早期診断法は存在しない。近年開発された異常型プリオン蛋白（PrP）試験管内増幅法（RT-QUIC法）はプリオン病罹患者の脳や髄液中に含まれる異常型PrPを検出可能とした高感度アッセイ系である。本研究では、プリオン病の早期診断を目標に、容易に採取可能な血液・尿等の体液よりプリオン診断を可能とする発展型QUIC法を構築する。大量試料や高濃度試料から微量存在する異常型PrPを濃縮し、RT-QUIC法の感度を上げることで初期症状患者の診断を目指す。他成分を多く含む高濃度試料はQUIC反応を阻害するため、ここではメタルパウダーを用いて異常型PrPを他成分より分離し、その試料（濃縮PrP）を用いたRT-QUIC法を構築する。令和5年度は、前段階としてメタルパウダーが本研究遂行に有用であるかを検討した。様々なメタルパウダーは段階希釈した異常型PrP陽性脳乳剤とインキュベートし、結合能等を確認したところ、メタルパウダーの材質により実用性に差が認められた。そこで材質を一つに固定してQUIC反応への影響を検討した（阻害、または偽陽性の出現）。結果、パウダー存在下ではQUIC反応が完全に抑えられてしまった。パウダーは保存液としてグリセロールを用いており、沈殿速度を調節することにより試料とインキュベート可能としている。QUIC反応阻害要因を検討したところ、パウダー、グリセロール両方が原因であることが解明された。そのため、パウダーは段階希釈試料とインキュベート後、PBS(-)にてリンス後、純水に浸し、その上清を用いてQUIC法を試みたところ、陽性シグナが得られた。詳細なプロトコルを確立後、様々な濃度の牛胎児血清FBSまたは尿を用いて段階希釈実験を行い、最適血清・尿濃度を決定した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度は、「メタルパウダーを用いた異常型PrP検出最適条件」および「血清中の異常型PrP検出条件」を決定させることを目標としてきた。まず、いくつかのメタルパウダーを用いて、本研究に有用な素材を決定した。また、メタルパウダーと試料のインキュベート方法およびその後の調整等の問題点等が発覚し、現時点での最適プロトコルを決定した。またスパイクテストとしてクロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）罹患者脳乳剤をPBS(-)にて段階希釈してパウダーを用いたRT-QUIC法（Powder-QUIC法）にが有用であるかを検討した。結果、偽陽性が検出されることはあるが、QUIC反応においては陽性結果が得られた。現在、偽陽性を抑える条件を検討しているところである。また、ヒト血清の代替として牛胎児血清（FBS）やヒト健常人尿を用いた通常のRT-QUIC法を行い、血清および尿のQUIC法に用い得る最適濃度を検討した。
Strategy for Future Research Activity	令和6年度は、メタルパウダーを用いたQUIC反応時における偽陽性を抑える条件を決定する。また、プリオン感染脳サンプルにおける異常型PrPを検出できる最高脳乳剤量と最低異常型PrP濃度を調べる。 CJD罹患者の髄液、血清、尿は（健常人等の非CJD検体についても）現在研究分担者の佐藤克也を中心に回収中である。それら検体を用いた解析（RT-QUIC法およびPowder-QUIC法）を遂行し、本法の有用性を検討していく予定である。
Causes of Carryover	本研究では、RT-QUIC法の基質として多くリコンビナント蛋白を要する。令和５年度に購入予定であったNi-NTAスーパーフローアガロースはそれらリコンビナント蛋白の精製に有用である。しかしながら、現時点では当研究室にリコンビナント蛋白のストックがあったことから、今年度は購入しなかった。今後、本研究を遂行する上でさらに多くのリコンビナント蛋白を必要となるため、次年度購入することに変更した。