2023 Fiscal Year Research-status Report

ICA69に対する免疫機構の破綻と1型糖尿病および自己免疫性内分泌疾患への影響について

Research Project

Project/Area Number	23K07234
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	田嶼朝子東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (00328337)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Keywords	1型糖尿病 / 自己免疫性内分泌疾患 / ICA69 / 免疫寛容
Outline of Annual Research Achievements	1型糖尿病は自己免疫疾患の一つであり、他の自己免疫性内分泌疾患を併発しやすい。その場合は1型糖尿病単独である時よりも血糖管理が困難になりやすく、患者の予後に影響する。1型糖尿病と他の自己免疫性内分泌疾患の合併においては免疫寛容の破綻が関連していると推測し、1型糖尿病の自己抗原の一つであるICA69が複数の臓器に発現していること、胸腺においてICA69の発現を抑制すると複数の組織に自己免疫反応が惹起されることに着目し、本研究を計画した。本研究ではICA69に対する自己免疫機構が破綻すると、1型糖尿病や併発する自己免疫性疾患の発症につながるという事象の解明を目的とする。研究対象としてICA69をノックアウトした遺伝子組換えNODマウス（ICA-NODマウス）を用いた。繁殖は雄・雌共にICA-NODマウスのヘテロ欠損型を使用するが、ヘテロ欠損型の雌マウスは野生型と同様に糖尿病を発症しやすく、妊娠を契機に高血糖をきたすこともある。その場合は繁殖に使用できなくなるが、ヘテロ欠損型の雌マウスは雄マウスよりも出生数が少なく不足しやすいため、野生型の雌マウスを一時的に繁殖に使用する必要があった。 HE染色で各組織におけるリンパ球浸潤の程度を確認したところ、糖尿病発症前の段階で膵臓ランゲルハンス氏島にリンパ球の存在を認めたが、遺伝子型による差は明らかでなかった。末梢リンパ節における制御性T細胞の割合は、ヘテロ欠損型と比較してホモ欠損型でやや低下していたが、ヘテロ欠損型の中でも個体差があり野生型との差がみられないこともあった。検体数が少なく統計学的な評価はできなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason ICA-NODマウスはとくに野生型ならびにヘテロ欠損型の雌において糖尿病を発症しやすく、妊娠により高血糖が惹起されることもある。繁殖中のヘテロ欠損型の雌マウスが高血糖を呈した場合は使用することができなくなり、適切な雌マウスが不足することがあったため一時的に野生型の雌マウスを用いた。その間は実験に使用できるマウスが不足し、該当する週数で検体を採取できないことがあった。免疫組織染色ならびにフローサイトメトリーにおいてはコントロールを用いた実験段階でそれぞれ試薬の濃度調整を要している。またフローサイトメトリーでは細胞を標識抗体で処理する途中過程で冷蔵保管することも可能であるが、その経過時間によって解析上細胞の分布が異なったため、実験条件を最適化することに時間を費やした。いずれにおいても採取できた検体数が少なかったため、実験が滞った。
Strategy for Future Research Activity	HE染色、免疫組織染色については膵臓、甲状腺、唾液腺の検体数を増やす。HE染色では組織中のリンパ球浸潤の程度をスコア化し、定量的な評価を行う。免疫組織染色では各組織に対してCD45、CD4、CD8、インスリン、グルカゴン、ICA69の各抗体を用い、インスリンやICA69の発現ならびにCD4陽性細胞やCD8陽性細胞の存在を確認する。また脾臓ならびに腋窩・腹膜・膵臓から末梢リンパ節を採取し、分離した細胞をCD4、CD8、CD25、Foxp3で染色する。染色した細胞はフローサイトメトリーを用いて解析し、制御性T細胞（CD4+/CD25 +/Foxp3+）の割合を確認する。以上を野生型とヘテロ欠損型において比較し、ICA69発現の有無による差を検証する。
Causes of Carryover	実験に必要なICA-NODマウスの系統は維持できているものの、繁殖が一時的に滞ったこともあり、該当する遺伝子型や週数のマウスが揃わなかった。実験を行った際は在庫の試薬を使用し得たため新たに購入する必要がなく、初年度に予定していたよりも実験に必要な費用が非常に少なかった。次年度も、マウスの飼育および繁殖を継続するために実験動物施設の使用費が必要である。その他、血糖測定、遺伝子型を同定するためのDNA抽出およびPCR、組織染色とその検体処理、フローサイトメトリーを行うために必要な試薬を購入する予定である。