2023 Fiscal Year Research-status Report
Protein-protein interactions as potential therapeutic targets for epileptic encephalopathy
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23K07259
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
荻原 郁夫 日本医科大学, 医学部, 准教授 (30373286)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | てんかん性脳症 / 疾患プロテオーム / 電位依存性ナトリウムチャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
てんかん性脳症は頻回のけいれん発作に知的・行動・運動の発達遅滞を伴う疾患群であり、コントロール不良で難治なことが多い。遺伝子の突然変異に起因するものもあり、電位依存性ナトリウムチャネルα1(Nav1.1)や線維芽細胞成長因子12(FGF12)、Goタンパク質αサブユニット(Gαo)をコードする遺伝子が原因遺伝子として報告されている。本研究は原因遺伝子間に共通の発症基盤を仮定してNav1.1とFGF12、Gαoの相互作用を解析している。
Nav1.1のN末側、ループI,II,III、C末側にある細胞内ドメインについて、検出を容易にするタグ標識を付加した発現ベクターを領域別に構築した。FGF12とGαoについてもタグ標識を付加したコンストラクト、そして赤色蛍光タンパク質を同時に発現するコンストラクトを作製した。そして、Nav1.1部分領域のうちで十分な発現量が得られたC末端領域について、弱いながらFGF12との結合を認め、構造解析から予測された結合部位へのアミノ酸置換がそのタンパク質間結合の強度を上昇させた。発現量が非常に低いもののN末側領域についてもFGF12との結合を示す可能性が示されている。さらに、Nav1.1部分タンパク質と疾患関連FGF12変異体の結合が示唆されている。
ナトリウムチャネルβ1,2サブユニットと緑色蛍光タンパク質を同時に発現するベクターを作製し、Nav1.1とFGF12と共に培養細胞に強制発現させた。そして、緑色ならびに赤色蛍光を同時に発する細胞にホールセルパッチクランプ法を適用した。FGF12の疾患関連変異体も実験に加え、変異によるNav1.1の電気生理学的性質の変化を解析している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Nav1.1部分領域発現ベクターについて、C末端領域のみの解析で十分な可能性はあるが、N末側、ループI,II,IIIで十分な発現量が得られておらず、改善を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Nav1.1とFGF12の共発現について、Nav1.1とFGF12に関連するてんかん性脳症に共通の発症基盤が存在するかについてさらなる電気生理学的、免疫組織学的解析を進める。また、Nav1.1とGαoの結合の詳細を生化学的に明らかにし、Gαoとこのタンパク質と共役するグルタミン酸受容体タイプ6(mGluR6)がNav1.1の電気生理学的性質と細胞内局在に及ぼす影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
（理由）牛胎児血清を含む細胞培養関連試薬やトランスフェクション関連試薬、免疫沈降・ウエスタン関連試薬は大学研究室配分研究経費で購入したものの中から一部を使用させてもらった。
（使用計画）細胞培養関連試薬、免疫沈降・トランスフェクション関連試薬、標本作製用器具、電気生理学的解析試薬を購入する。
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