2023 Fiscal Year Research-status Report

心内膜特異的に発現するvon Willebrand因子の生理的意義と発現調節機構の解明

Research Project

Project/Area Number	23K07567
Research Institution	National Cardiovascular Center Research Institute
Principal Investigator	樋口由佳 (江浦由佳) 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 上級研究員 (30443477)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Keywords	VWF / フォンヴィレブランド因子 / 心内膜細胞
Outline of Annual Research Achievements	止血因子von Willlebrand factor (VWF)は、これまでによく知られた止血反応における重要性だけでなく、血管新生や感染に伴う血栓症などでも注目されている。VWFは、血管内皮細胞および巨核球/血小板で産生されることが知られており、由来の異なるVWFの性状や機能の違いについても議論となっている。心内膜細胞は、心臓の内腔を覆う細胞であり、通常の血管内皮細胞とは細胞系譜およびその挙動も異なる。我々は、公開シングルセルデータの結果を検索する中で、心臓ではVWFが心内膜特異的に発現していることに着目した。心内膜細胞に限局して高発現するVWFには、心臓における何らかの特異的な機能があるという仮説のもと、解析を開始した。まず、シングルセルデータにあるようにVWFが心内膜細胞に特に強く発現することをマウス心臓の抗VWF抗体による組織染色によって確認した。その結果、 VWFが心内膜に高発現していることを確認できた。心内膜細胞におけるVWFの機能を探るために、VWFの分子性状や協働因子を調べることとした。そのために、マウス心内膜細胞の単離が必要と考えたが、これまでにマウス心内膜細胞の単離についての報告は存在していない。そこで、ラットおよびブタでの単離方法を参考に、条件検討を進めることとした。しかし、既報のラットと比較して1/20程度のサイズのマウスでは、心内膜への酵素液の暴露方法などの手技を踏襲しても同様の結果が得られないことが明らかとなった。そこで、心内膜細胞以外の剥離を最大限抑える酵素液の暴露方法の検討、酵素の種類の検討を進めた。また、これと並行して、心内膜細胞における機能と比較し、その特徴を浮き彫りにするため、VWFの供給源として知られる血管内皮細胞および巨核球/血小板由来のVWFを用いた比較解析の準備も進めた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究の根幹である心内膜細胞におけるVWFの高発現について、マウス心臓の免疫組織染色により解析をおこなった。その際、VWFKOマウスをネガティブコントロールとして使用した。その結果、野生型マウスにおいて、心内膜における強い染色を検出し、マウス心内膜におけるVWFの高発現を確認することができた。マウス心内膜細胞の単離については、研究開始当初は、ラットおよびブタでの単離方法を参考に、条件の軽微な修正である程度の結果が得られると考えていたが、実際に実施してみると、既報のラットと比較して1/20程度のサイズのマウスでは、心内膜への酵素液の暴露方法などの手技を踏襲しても同様の結果が得られないことが明らかとなった。そこで、心内膜細胞以外の剥離を最大限抑える酵素液の暴露方法の検討、酵素の種類の検討を進めた。これらの解析によりマウス心内膜細胞の単離方法が確立できれば、心内膜研究にとって有用な方法となると考えている。
Strategy for Future Research Activity	今後も引き続き、心内膜細胞以外の剥離を最大限抑える酵素液の暴露方法の検討、酵素の種類の検討を進める。これらの解析によりマウス心内膜細胞の単離方法が確立できれば、心内膜研究にとって有用な方法となると考えている。マウス心臓の心内膜細胞の単離方法については、完成次第、論文化を進める。また、心内膜細胞に発現するVWFの分子性状について、VWFマルチマーの様式や血小板との結合親和性などについて、検討する必要があると考えている。その特徴を浮き彫りにするためには、VWFの供給源として知られる血管内皮細胞および巨核球/血小板由来のVWFを用いた比較解析が有効である。心内膜細胞に発現するVWFの特異的機能については、心内膜細胞に特異的なVWFの協働因子が関与するのではないかと推察している。そこで、心内膜細胞のWeibel-Palade bodies（WPB）に含まれる因子と血管内皮細胞のWPBに含まれる因子の比較やVWF抗体による免疫沈降などを進めたい。
Causes of Carryover	心内膜細胞の単離方法の確立後に進める予定の試薬類への支出が次年度に持ち越したため、次年度使用額が生じた。