2023 Fiscal Year Research-status Report
呼吸運動に近似したメカノバイオロジーによるCOPDの解明と橋渡し研究への展開
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23K07604
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
福山 聡 九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (50380530)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 伸展 / PCLS / ヒト初代高分化気道上皮シート / COPD |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、肺気腫を認めるマウス肺のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｕｔ ｌｕｎｇ ｓｌｉｃｅ（ＰＣＬＳ）作成のプロトコルを樹立した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺をＬｏｗ ｍｅｌｔｉｎｇ ａｇａｒｏｓｅで固定し３００μｍで薄切し、培養液にエラスターゼ２．５μｇを加え一晩刺激し肺胞腔の拡大を確認した。肺気腫モデルマウス肺のＰＣＬＳをシリコン容器に貼り付け、長径が＋２ｍｍ～６ｍｍなるよう伸展しＤＩＣ画像で肺胞腔の伸展を評価した。オープンソースソフトウェアＮｃｏｒｒを用いて伸展の程度、場所を解析できることを確認した。それによりエラスターゼ刺激肺気腫モデルＰＣＬＳでは、伸展による張力強度のばらつきが大きいことを見出した。またヒト初代高分化気道上皮シートをシリコン容器内に作成し、剥離しないで伸展できる条件を検討しプロトコルを樹立した。ヒト初代高分化気道上皮細胞をフィブロネクチンとコラーゲンでコーティングしたシリコン容器に播種し、約４日後コンフルエントを確認後、伸展装置で長径＋２ｍｍ～６ｍｍとなるよう４時間伸展する。これにより伸展刺激でヒト初代高分化気道上皮細胞のアクチン線維の方向が伸展の垂直方向に一定に並ぶことを見出した。さらに伸展後のＰＣＬＳ、ヒト初代高分化気道上皮細胞をＴＲＩｚｏｌ内で懸濁し、ＲＮＡ精製後ｑＰＣＲを行い遺伝子発現解析が可能であることを確認した。タンパク質発現はサンプル量が少ないためウエスタンブロットによる解析が困難で、上清のＥＬＩＳＡで評価することとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請した研究計画の令和5年度施行予定項目である（a）PCLSに適用する周期的負荷の最適化条件の確立、（b）周期的負荷下のメカノセンサー動態解明を遂行した。また令和6年度施行予定の（c）メカノトランスダクションとアウトプット評価を順調に開始できているためである。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請書の実験計画通り、令和6年度は（c）メカノトランスダクションとアウトプット評価に注力する。各種分子のプライマー作成とqPCR、培養上清のELISA、蛍光免疫染色を行い、伸展および肺気腫による分子発現や局在の変化を評価する。またbulk RNA-seqを用いて伸展によるmRNA発現変化の網羅的解析も検討する。
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| Causes of Carryover |
プロトコル樹立のための条件検討が順調であり、必要とした消耗品が予定より少量で済んだため。
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