バリア機能障害機序とアトピー性皮膚炎発症の関連メカニズムの解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K07741
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 小川 英作 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 講師 (20451586)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: AhR / KLK

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、皮膚のバリア機能とAD発症メカニズムの因果関係の解明であり、大気汚染物質によるAhRの活性化がバリア機能障害を誘導し皮膚炎が発症するのかという点である。AhRによるKLKsの誘導の解析を本年度は予定している。AhRを活性化した培養表皮細胞では、KLK５及びKLK７をコードする遺伝子の発現が上昇していることを示すデータを得た。そこで、この培養表皮細胞を用いて皮膚バリア機能に関連する遺伝子の発現を解析し、KLK分子についてはプロテアーゼ活性を指標に解析する。また、KLK分子はコルネオデスモゾームを分解することがわかっているため、マウス組織や培養表皮細胞で構成要素のコルネオデスモグレンの動態を確認する。
培養表皮細胞から、蛋白を抽出することはできている。しかし、それをウェスタンブロット法を用いて、解析しているが、KLKの発現をうまく見出すことができない。また、培養細胞にてコルネオデスモゾームを綺麗に免疫染色で、示すことができていない。
次に、AhRによるKLKsの制御機構の解析も予定している。AhRによりKLKsが調整されているかは、ChIP assayを行いプロモーター領域に結合するかを検討している。また、KLKsを抑制することにより、コルネオデスモグレインの分解が抑制されうるかも確認する。しかし、ここでもChIP assayの条件設定に戸惑っているため、最終的な結合を見ることができていない。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

研究実績に記載の通り、実験の条件設定に手間取っているからである。コルネオデスモゾームを免疫染色で綺麗に示すには、免疫染色条件を複数検討しなければならない。特に、コルネオデスモゾームの抗体が重要と考えているため、複数の抗体を検討している。次に、ChIPassayはとても条件設定に苦慮している。場合によっては、ChIPassay以外の手段を検討せねばならない。

Strategy for Future Research Activity

AhRによるKLKsの制御機構の解析をChIPassayを用いて行なっている。しかし、条件検討が進まない可能性がある。この場合は、令和6年度以降に行う予定である、AhR-CAマウスにおけるバリア機能障害とKLKの発現を、マウスを用いて、行うことを優先したい。

Causes of Carryover

現在、培養表皮細胞の蛋白を用いてウェスタンブロット法による蛋白の解析と培養表皮細胞を用いた免疫染色が滞っている。これは条件設定が複数回必要であるが、十分にできていないからである。この状況を打開するため、培養表皮細胞をさらに多く準備し、蛋白をより多く抽出し、サンプルを増やす必要がある。解析に用いる抗体も数種類を購入し、実験をかず多くすることを計画している。