Effects of ANGPTLs on dyslipidemia and atherosclerosis: analysis using gene-modified rabbits.

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K08000
• Research Institution: Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences
• Principal Investigator: 西島 和俊 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 動物資源共同利用研究センター, 教授 (70435874)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 範 江林 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (60272192) ; 新見 学 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (80644898) ; 北嶋 修司 佐賀大学, 総合分析実験センター, 准教授 (70284643) ; 松久 葉一 佐賀大学, 総合分析実験センター, 助教 (20754253)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Keywords: 脂質代謝異常 / 動脈硬化 / ANGPTLs / ウサギモデル

Outline of Annual Research Achievements

血中のトリグリセリド（TG）レベルは動脈硬化や心筋梗塞などの心血管系疾患の主要な危険因子であり、我が国でも社会的な関心事となっている。ANGPTLsの様々な機能の中でも、血中TGを加水分解するリポ蛋白リパーゼ（LPL）の抑制を介したTG濃度の制御については、脂質代謝異常の原因として注目されているが、特に、マウスで発現が見られないANGPTL5については、解析がほとんど進んでいない。そこで、超低比重リポタンパク質（VLDL）と低比重リポタンパク質（LDL）中にアポリポ蛋白（apo）B-100が含まれる、コレステリルエステル転送蛋白（CETP）活性がある、肝性リパーゼが細胞膜に結合するなど、脂質代謝系がヒトと類似し、内在性ANGPTL5を有するウサギを対象として、遺伝子欠損モデルの作製を進めた。
メスウサギ2匹に妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）を投与して過排卵を誘起し、人工授精を行うとともにヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を投与することにより受精卵21個を獲得した。ウサギのANGPTL5遺伝子を標的としたCRISPRコンストラクトを作製し、Cas9たんぱく質とともに、前核期胚19個の雄性前核内にマイクロインジェクションした。これらをhCG投与により偽妊娠させた仮親雌の卵管内に移植したところ、妊娠・出産した。得られた産仔は1匹のみであったが、尾部の皮膚の一部を採取し、DNAを抽出、シーケンスを行った。その結果、ANGPTL5のExon6に8塩基の欠損が確認され、また、シーケンスの波形が単一であったため、ホモ欠損である可能性がある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに、ANGPTL5遺伝子欠損ファウンダーウサギが得られ、順調に育っている。ファウンダーは1匹のみであるが、構築したCRISPR/Cas9システムは効率的に機能し、バックアップの獲得も出来ると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

ANGPTL5遺伝子欠損ファウンダーウサギが十分に成長した段階で、野生型ウサギと交配を行いF1世代（ヘテロ遺伝子型）を得る。十分な個体が得られれば、血液中の総cho（TC）、高比重リポ蛋白(HDL)-cho、TGおよびヘパリン投与後に採取した血液を用いてLPLの活性等、基本的な脂質代謝特性を確認する。ヘテロ個体同士を交配してホモ個体を獲得して、脂質代謝解析を行う。ANGPTL5遺伝子欠損ウサギのバックアップおよびANGPTL8遺伝子導入ウサギを得るために、マイクロインジェクション実験を継続して行う。

Causes of Carryover

ANGPTL5遺伝子欠損ファウンダーウサギが得られたのが年度末にかけての時期だったため、F1、F2世代の獲得、基本特性の解析を次年度に行うこととする。