2024 Fiscal Year Research-status Report

Development of neutron capture therapy using adenovirus genome-terminal protein complex for drug delivery

Research Project

Project/Area Number	23K08570
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	濱聖司広島大学, 脳・こころ・感性科学研究センター, 特任准教授 (40397980)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	星正治広島大学, 平和センター, 名誉教授 (50099090) 切畑光統大阪公立大学, 研究推進機構, 特任教授 (60128767) 青木一教国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (60270675) 遠藤暁広島大学, 先進理工系科学研究科(工), 教授 (90243609) 黒澤真城大阪大学, 核物理研究センター, 特任講師(常勤) (10462681) 服部能英大阪公立大学, 研究推進機構, 特任講師 (50514460) 齋藤太一広島大学, 医系科学研究科(医), 研究員 (40457247) [Withdrawn] 堀江信貴広島大学, 医系科学研究科(医), 教授 (70380912)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Keywords	中性子捕捉療法 / アデノウイルスベクター / ホウ素修飾 / 悪性グリオーマ / ドラッグデリバリーシステム
Outline of Annual Research Achievements	ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)は、腫瘍細胞に選択的に作用する唯一の放射線治療法で、腫瘍集積性の高いホウ素化合物の開発が重要な鍵となる。我々は活性化ドデカボレート類(ADB)を合成してアデノウイルベクターに化学修飾させてウイルス1個あたり4個のホウ素クラスターを結合させて、培養細胞に感染させる実験を行っている。これまでの実験では、専用のホモゲナイザーと超遠心を用いて核分画の分離を行った。そして、感染細胞、あるいは感染細胞から抽出した細胞核分画を㈱島津テクノリサーチに依頼してマイクロウェーブ分解―ICP質量分析法にて10Bを解析した。その結果、細胞内への移行は確認できたが、核内への十分量の移行は確認できなかった。単純にアデノウイルス表面の化学修飾では細胞核内へのホウ素化合物の十分量の移行は困難である可能性が示唆された。そこで、アデノウイルスベクターそのものの改変を行う予定としている。本年度は組み換えDNA実験の変更・新規申請を行うとともに、使用する超遠心機の調整・試薬類の準備、実験プロトコールの見直しなどを行って研究の準備を整えた。来年度はLacZ発現アデノウイルスベクターを濃縮精製してアデノウイルスの改変を行う予定としている。また、アデノウイルベクターを用いた中性子捕捉療法の他分野への応用可能性についても探っているので、引き続いて応用可能性についてもも検討を続けていく。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason アデノウイルベクターの改変のプロトコールが古く、超遠心機の条件、試薬の調整などに手間取ってしまったため。時間はかかったが何とか準備が整ったことから実験に進めていく予定としている。
Strategy for Future Research Activity	次年度では、TPCが結合したLacZ発現アデノウイルゲノムを塩酸グアニジン溶液と超遠心で精製し、ELISA法、ICP質量分析で10B量を計測しながらADBを化学修飾させる（AxTPCgenADB）。そして、悪性グリオーマ培養細胞にAxTPCgenADBをリポソーム法などで導入し、LacZの発現をβ-gal染色で確認して遺伝子が細胞内に導入されたことをチェックしながら、核内への移行性と遺伝子発現能を保ったままで最大量のADBを結合させたAxTPCgenADBの反応条件を求める。その後、細胞内、ならびに細胞核内への移行について、これまでの結果と比較・検討する予定である。
Causes of Carryover	実験手法の予備的な検討（超遠心機、試薬、実験プロトコールの見直し）に手間取ったため。ただし、予備的な準備が概ね終了したことから、今後の本実験が行いやすくなった。次年度はLacZ発現アデノウイルベクターを濃縮精製してアデノウイルスの改変を行い、細胞内へのホウ素化合物の移行について検討を行う予定である。そのために、具体的に次年度に経費の使用を計画している項目は、以下を予定している。（１）超遠心と塩酸グアニジン溶液を用いて、末端タンパク結合アデノウイルゲノムを抽出。（２）リポソーム法による細胞内遺伝子導入。（３）遺伝子発現（LacZ発現）をβ-gal染色で確認。（４）核分画の分離。（５）全細胞と核分画を㈱島津テクノリサーチに依頼してマイクロウェーブ分解―ICP質量分析法にて10Bを解析。（６）論文作成。また、アデノウイルスベクターを用いた中性子捕捉療法の他分野への応用可能性を検討していくことにも経費を使っていく予定としている。