空間トランスクリプトーム解析による血液精巣関門の成立の解明と男性不妊治療への応用

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K08719
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 加藤 大貴 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (00620931)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (10621063) ; 松本 大輔 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (30906540) ; 林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134) ; 水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: セルトリ細胞 / 男性不妊 / 停留精巣

Outline of Annual Research Achievements

ラットの精巣を用いて、10x Genomics社のVisiumの技術により精細管内のblood-testis barrier（BTB） の領域における遺伝子発現を網羅的に解析することを試みた。しかし、10x Genomics社の担当者とdiscussionをするうちに、関心領域を物理的に切り出す精度が低く、現在ある技術では、私たちが当初の計画したBTB周囲の空間領域を切り取って解析することができないことが判明した。数年、技術の進歩を待つか、あるいは、他の方法に実験手法を切り替えて、BTBの成立過程を明らかにする目標に近づくことを選択することとなった。後者を選択し、前思春期のラット精巣をSingle cellに分散、停留精巣とコントロールの精巣の各種細胞の遺伝子発現を各々比較する方法を試した。酵素処理を行い、single cellに分散することを試みたが、精度が不良で解析に至らなかった。実験室内ではsingle cell化することに限界があり、受託研究をする方針に切り替えた。そこで、核抽出の技術を用いてBTBの成立過程に関わる遺伝子制御ネットワークの解明を行う方針としThe Chromium Single Cell ATAC(Assay for Transposase Accessible Chromatin) Solution の手法を用いることにした。受託依頼先とWebにてミーティングを行い、先方とディスカッションを行った。停留精巣における造精機能障害の原因の仮説は、BTBの構築障害により精細胞の減数分裂が正常どおり進まないこと、としている。しかし、ディスカッションを行った際、思春期後では精巣内の細胞の種類が増大し、解析が複雑となる。何らかの成果が得られたとしても、データ自体を解釈できない可能性がある、ことを指摘され、今一度、実験手法の見直しを行うこととなった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

上記のように、本年は実験を進めるよりも、既報の報告の論文を読んで解析手法や結果の解釈について学ぶため、座学に割く時間が多くなった。受託費用を抑えるため、新たなキットを用いてシングルセル化とデブリの除去を試みたが、条件がなかなか整わず、解析までいたらなかった。

Strategy for Future Research Activity

受託研究として、The Chromium Single Cell ATAC(Assay for Transposase Accessible Chromatin) Solution の手法を用いて、BTBの成立過程に関わる遺伝子制御ネットワークの解明を行う。

Causes of Carryover

研究の実施が年度内にできなかったため。次年度では、研究と解析を進めていくことで受託費用や解析費用、人件費が生じて、学会発表等で旅費も生じる見込みである。