ステロイド・甘草の内耳作用機序解明：内耳特定細胞の微量RNA定量解析法を用いて

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K08987
• Research Institution: Kagawa University
• Principal Investigator: 松原 あい 香川大学, 医学部附属病院, 特命助教 (50807758)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Keywords: 内耳 / RT-qPCR / ステロイド / グリチルレチン酸

Outline of Annual Research Achievements

デキサメタゾン・プレドニゾロン・グリチルレチンサン・コントロール試薬液を、それぞれラットに腹腔内注射し、PFAにて灌流固定後採取した側頭骨から、レーザーで蝸牛血管条・前庭暗細胞・内リンパ嚢上皮細胞のみをそれぞれ切り出し回収した（レーザーマイクロディセクション）。回収したサンプルから抽出した各RNAサンプルの量と断片化の程度を検討したところ、内リンパ嚢上皮はRT-qPCR施行可能な質と量を確保できたが、蝸牛血管条はRNAの断片化が激しくRT-qPCRにて増幅が見られなかった。蝸牛血管条に関しては、サンプル採取の際の扱いやサンプル量などの検討を重ねて、徐々にRNAの質・量とも改善し、安定した収量が得られつつある。前庭暗細胞も同様に、RNAの収量が著しく低く、レーザーマイクロディセクションにて収集する細胞数の増加を目指すことで、RT-qPCR施行可能な質と量を得られるよう試みている。
RNA抽出できたサンプルからRT-qPCRにて、ターゲットであるENaC・NCC・Na+, K+-ATPase・アクアポリンのmRNA発現を比較検討を進めている。しかしながらプレドニゾロン群はコントロールとの差が現れず、投与量・期間など投与プロトコールを変更、再検討を行っている。グリチルレチン酸、デキサメタゾン投与群に関しては、一定の結果の傾向が現れるにはサンプル数がまだ不十分で、RNA抽出サンプル数を増やしていくよう、実験を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

先に述べたように、レーザーマイクロディセクションにて回収した細胞から抽出したRNAサンプルに関して、蝸牛血管条と前庭案細胞は、RNAの断片化や細胞量の少なさにより、安定してRT-qPCR可能なレベルにまだ至っていない。

またプレドニゾロン群は投与量・期間など、これまでの論文等から決定した当初の投与プロトコールを変更し、再検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

安定したRT-qPCR結果を得るために、蝸牛血管条・前庭暗細胞に関しては、サンプル採取の際の慎重な扱いやレーザーマイクロディセクションで回収する細胞量を増やすなどの細かい検討を行っていく。それによって、安定したRT-qPCR施行可能なRNAの質と量を得られるよう進めていく。
さらに、有意差ある結果を得るために、それぞれの投与群・細胞においてRNA抽出サンプル数を増やしていくよう、実験を進めていく。
プレドニゾロン群の投与プロトコールを早期に再確立し、グリチルレチン酸、デキサメタゾン投与群とのターゲットRNA発現量の差を検討していく。

Causes of Carryover

先に述べたように、レーザーマイクロダイセクションからのRNA抽出・RT-ｑPCRのデータ収集が予定より遅れている状況である。R5年度に計画していた内リンパ嚢上皮細胞・蝸牛血管条・前庭暗細胞の免疫染色であるが、RT-ｑPCRの予備データが揃ったあとに行う方が効率的であるため、実験計画を変更し先ずはレーザーマイクロダイセクションとRT-ｑPCRを優先した。そのため免疫染色に必要な抗体や試薬を購入せず、未使用額が生じた。次年度はデータを蓄積し免疫染色を行う計画であり、今年度未使用分を次年度使用としてお認め頂きたい。