2023 Fiscal Year Research-status Report
難治性潰瘍での変性コラーゲンの局在証明、再上皮化遅延の病態解明とその治療法開発
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23K09079
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
久保 美代子 岡山大学, 医学部, 客員研究員 (00098609)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 健一 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (00711798)
米澤 朋子 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (30304299)
大橋 俊孝 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (50194262)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 難治性潰瘍 / 変性コラーゲン / 再上皮化 / β3インテグリン遺伝子導入ヒト表皮角化細胞 / 再生医療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１.褥瘡9例と熱傷（コントロール）9例を対象にし、BindCOL, biotin-conjugatedを使用して変性コラーゲン(gelatin: GEL)の局在を調べた。ホルマリン固定、パラフィン包埋標本、5μm切片で検査した。その結果、本試薬使用条件下で熱傷1例に真皮内の変性コラーゲン陽性を観察した。褥瘡では変性コラーゲンの局在を検出できなかった。現在、類似試薬（Collagen Hybridizing Peptide）を使用して再度検査中である。
2.正常ヒト表皮角化細胞(normal human keratinocyte: NHK)、β3インテグリン・サブユニットcDNA導入ヒト表皮角化細胞（αvβ3発現HK）のGEL上でのin vitroの諸細胞機能を1時間の細胞接着アッセイ、14時間のscrach wound healing assay、4日間の細胞増殖アッセイ（CCK-8 assay)により検査した。GELの種類｛Type A (Sigma)、Type B (Sigma)，低エンドトキシンゼラチン（nippi）｝、ゼラチン調整方法｛オートクレーブ法（121℃、20分）、煮沸法（50℃、20分）｝、GEL濃度 (0-10,000 μg/ml)などの違いによる影響を調べた。培地は無血清・低Ca培地 (0.1 mM)を使用した。その結果、αvβ3発現HKの細胞接着、細胞移動はすべての条件下でNHKに比べて有意に増加した。両細胞の細胞増殖はGELの種類、調整方法により幾分異なり、GEL濃度依存性の細胞増殖曲線を示した。それらの共通所見として、NHKは低濃度（10-100μg/ml）GEL上でGEL 0に比べて増殖が有意に減少した。またαvβ3発現HKの増殖はType A、煮沸法、高濃度(1,000-10,000μg/ml)GELを除くすべてでNHKと比べて有意に増加した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和5年度
1.褥瘡9例と熱傷（コントロール）9例を対象とし、BindCOL, biotin-conjugatedを使用して変性コラーゲン(gelatin: GEL)の局在を調べた。
2.正常ヒト表皮角化細胞 (NHK)、β3インテグリン・サブユニットcDNA導入ヒト表皮角化細胞（αvβ3発現HK）のGEL上でのin vitroの諸細胞機能（接着、移動、増殖）を調べた。
ほぼ計画どうりに実験が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度
3.変性コラーゲン上でのNHK、αvβ3発現HKのin vitroの細胞増殖、細胞形態の違いの機序解明を行う。具体的には、① 蛍光抗体法によりfocal adhesion形成を検索する。②蛍光抗体法、qPCRを行い、種々の濃度のGEL上で培養したNHK、αvβ3発現HKについてフィブロネクチン(FN)分布、細胞内のFN1 mRNAレベルを定量して比較する。③蛍光抗体法、qPCRにより GEL上での表皮角化細胞インテグリン（αv、α5、β1、β3）発現、MMPs発現の変化を蛋白レベルならびにmRNAレベルで検索する。④ RNAi法（FN1、ITGA5遺伝子を抑制するsiRNA使用）あるいはFN投与による細胞増殖の変化を検索する。
4.In vivoのヌードマウス難治性潰瘍モデルでNHK移植、αvβ3発現HK移植による変性コラーゲンに対する再上皮化促進効果の有無を比較検討する。
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| Causes of Carryover |
消耗品の購入について予定よりも安価に抑えることが出来たため、次年度使用額が生じた。残額については令和6年度の実験に必要な消耗品に使用する予定である。
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