2023 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of signaling in TRPV2-positive keloid-derived fibroblasts induced by stretch stimulation
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23K09081
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
峯田 一秀 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (70747815)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | ケロイド形成 / ケロイド由来線維芽細胞 / ストレッチ刺激 / TRPチャネル / TRPV2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ケロイド由来線維芽細胞にストレッチ刺激を負荷した際に、細胞内Ca2+濃度が一過性に過剰上昇するkeloid-specific subpopulation(約10%)の存在を誌面報告した。そこで、ケロイド由来線維芽細胞におけるTRP(transient receptor potential)チャネルの発現を個細胞単位で検証するために、シングルセル解析を計画し、ケロイド由来線維芽細胞(K-FBs)と正常皮膚由来線維芽細胞(N-FBs)におけるTRPチャネルの遺伝子発現について比較した。
独自の伸展刺激装置を用いて、K-FBsとN-FBsにストレッチ刺激(ひずみ量15%、12回/分、48時間)を負荷した後、10xGenomics社のsingle-cell RNA sequencing法を用いたライブラリー調整と次世代シーケンスを行い、専用ソフト(Loupe Browser)で解析した。
K-FBsあるいはN-FBsの検出総細胞数のうち1%以上発現したTRPチャネルは、TRPP2(K-FBs 29.5% vs N-FBs 30.2%)、TRPC1(8.5% vs 10.4%)、TRPC4(3.3% vs 3.7%)、TRPM4(4.8% vs 8.3%)、TRPM7(19.6% vs 22.7%)、TRPML1(25.7% vs 25.0%)、TRPML3(2.0% vs 4.0%)、TRPV1(1.1% vs 1.4%)、TRPV2(11.5% vs 2.3%)であった。このうち、TRPV2のみK-FBsで有意に発現しており、それ以外はN-FBsで有意に発現していた。細胞免疫染色においても、K-FBs中の約10%で活性化型TRPV2抗体の発現が観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度予定していた細胞免疫染色の実験については終了した。フローサイトメトリーについては、予備実験が終わったため、来年度に本実験を行う予定である。また、学会における口頭発表と紙面報告の準備を進めているところである。以上より、おおむね順調に進捗していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
シングルセル解析結果で、ケロイド由来線維芽細胞(K-FBs)は正常皮膚由来線維芽細胞(N-FBs)と比較し、ミトコンドリア環状DNAをコードする13種類の遺伝子発現量が有意に低いことが新たに判明した。そこで、K-FBsのミトコンドリアに異常があると仮定し、ミトコンドリア機能を調査した。
K-FBsとN-FBsのミトコンドリア呼吸(OCR: Oxygen Consumption Rate)は、基礎呼吸(KF:21.8 pmol/min vs NF:27.1pmol/min)、ATP産生量(17.7 pmol/min vs 21.9 pmol/min)、最大呼吸(40.5 pmol/min vs 62.6 pmol/min)、予備呼吸能(11.5 pmol/min vs 26.1 pmol/min)、非ミトコンドリア酸素消費量(7.2 pmol/min vs 9.3 pmol/min)、プロトンリーク(4.0 pmol/min vs 5.3 pmol/min)であり、いずれもK-FBsで有意に低いことがわかり、K-FBsではN-FBsと比較してミトコンドリアによるエネルギ―代謝が有意に低いことが示唆された。K-FBsにおけるミトコンドリアの好気的なATP産生の低下は、代償的に嫌気呼吸(解糖系)が優位である可能性があるため、検証を進めていく。
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| Causes of Carryover |
ミトコンドリア機能を調べるリアルタイム細胞外フラックスアナライザーが今年度途中に故障し、引き続き実験を継続するため、次年度使用額が生じた。また、国際学会に参加予定であったが、次年度参加することになり、翌年度分の研究費と合わせて、消耗品費と学会参加費として使用する予定である。
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