骨芽細胞のⅠ型コラーゲンと基質小胞の分泌経路におけるRabタンパク質の機能解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K09117
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 柿原 嘉人 新潟大学, 医歯学系, 助教 (40379938)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加来 賢 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (30547542) ; 三上 剛和 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80434075)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: 骨芽細胞 / コラーゲン / 基質小胞 / Rab

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題は、骨芽細胞の分化過程において、I型コラーゲンや石灰化に関わる基質小胞がどのように輸送され、最終的に細胞外へ分泌されるかについて解明することを目的とする。Rabタンパク質は、約60遺伝子から成る巨大ファミリーを形成しており、近年、様々な細胞種において、カーゴタンパク質の細胞内膜輸送に関与することが報告されているが、骨芽細胞においては、その知見が非常に乏しい状況にある。そこで、申請者らは、骨芽細胞におけるＩ型コラーゲンや基質小胞の細胞内輸送に関わるRabタンパク質を網羅的に同定することを試みる。まず、コラーゲン分泌のスクリーニング系の構築を行った。スクリーニングの最適条件を検討するために、マウス由来前駆骨芽細胞のMC3T3-E1細胞を用いて、ネガティブコントロールであるランダムsiRNAとポジティブコントロールであるCOLI遺伝子のsiRNAノックダウンを行い、分化誘導後、経時的にピクロシリウスレッド染色によってコラーゲン分泌を比較した。その結果、分化誘導４日後において最も顕著な差異が観察されたことから、この条件によってRab遺伝子の網羅的ノックダウンを試みた。１次スクリーニングの結果、１７のRab遺伝子siRNAノックダウンにおいてコラーゲン分泌の低下が観察された。現在、２次スクリーニングを開始し、顕著にコラーゲン分泌を低下させる遺伝子の単離を試みている。さらに、基質小胞の分泌に関与する遺伝子スクリーニングを行うため、骨芽細胞から分泌された小胞の定量解析システムの構築を行った。１次スクリーニングの結果、１０のRab遺伝子のノックダウンにおいて、基質小胞の分泌が低下することが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、MC3T3-E1細胞の骨芽細胞分化誘導時のsiRNAノックダウンの条件検討を行い、骨芽細胞のコラーゲン分泌と基質小胞分泌に関与するRab遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、コラーゲン分泌と基質小胞分泌のそれぞれに関与する可能性が高い遺伝子が単離され、本申請課題の第一段階をほぼ終えることができた。

Strategy for Future Research Activity

前述のスクリーニングの結果から、これまでに報告されていないRab遺伝子がコラーゲン分泌と基質小胞分泌に関与している可能性が示唆された。今後はそれらのRab遺伝子について、２次スクリーニングを行い、顕著な表現型を示すものに対して、細胞生物学的、生化学的解析を進めていく。

Causes of Carryover

購入予定の試薬の納品が輸送の都合上、年度内に間に合わなかったため。