Elucidation of the mechanism of progression of oral candidiasis - potential of cell surface proteins as new antifungal drug targets-

2024 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K09379
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 柴山 和子 東京医科大学, 医学部, 客員研究員 (60408317)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 太田 一正 東京医科大学, 医学部, 准教授 (30307376)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: Candida albicans / カンジダ症 / 口腔カンジダ症 / 真菌症

Outline of Annual Research Achievements

鉄獲得は、宿主環境において病原微生物が生存するための重要な課題である。Candida albicansは血清中のトランスフェリン結合鉄の利用能を欠くが、多くの微生物病原体と同様に、宿主生体内で増殖のために赤血球成分であるであるヘモグロビンを鉄源として利用することができる。また、本菌の病原性発揮にヘム鉄の利用が必要であることも知られている。
本菌の鉄の獲得においてリレーネットワーク様に働く一連のタンパク群であるRbt５ファミリーは、システインに富む固有のCFEM（Common in Fungal Extracellular Membranes）モチーフを有する。Csa1、Csa2、Pga7、Rbt5、Rbt51がこのファミリーに属する。
Csa1とRbt51は、本菌のバイオフィルム形成への関与が示されているが、鉄獲得における機能の報告はない。Csa２の鉄獲得機構への関与については，我々がCSA2欠失変異株を用いて検討を行った結果から、野生株および補完株と比較してヘモグロビンに対する親和性の低下と、ヘモグロビン利用能の減弱が認められた。Csa２が菌糸型増殖においてヘモグロビンを鉄源として取り込み，鉄獲得に重要な役割を担うことが示唆された。Pga7とRbt5の間ではヘムの移動が双方向に起こりうることが分かっており、ヘム獲得リレーにおいて両者が協力するというモデルが支持されている。各タンパクの機能は徐々に解明されているものの、CFEMモチーフ自体の役割はいずれのタンパクにおいても報告がない。このモチーフの特性を明らかにするため、モチーフ部分のみの欠損株構築テクニックの確立を目指し、新たな選択マーカーの利用を試みたが、構築には至らなかった。ゲノム中の特定の遺伝子を切断できるゲノム編集ツールを用いる手法を取り入れるため、プラスミドシステムの検討を行った。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

モチーフ部分のみの欠損株構築にあたり、新たな選択マーカーの利用を試みたが構築には至らなかった。また、ゲノム編集システムを取り入れたが、プラスミドの不具合により変異導入に時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

CFEMモチーフ部分のDNA配列に対する相補的な配列を含むguide RNAおよびその相補鎖を設計し、それらの断片をCRISPRベクターにクローニングする。作成したCRISPR-Cas9発現プラスミドをC. albicansへ導入し、CRISPR-Cas9システムにより標的領域の切断する。
このゲノム編集法により切断箇所に新たな配列を挿入することも可能なため、補完株の構築にも用いる予定である。

Causes of Carryover

今年度は学会発表旅費等を使用しなかった。
ゲノム中の特定の遺伝子を切断できるゲノム編集ツールを用いる手法を取り入れるためのプラスミドシステムの検討ををメインに行ったため、支出が予定より少なかった。
次年度に本プラスミドシステムを用いた変異株作製を続行するとともに機能解析を行い、予算を執行する予定である。