2024 Fiscal Year Research-status Report
新規生体内ゲノム編集法による低ホスファターゼ症モデルマウス作製とその応用
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23K09450
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| Research Institution | Asahi University |
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Principal Investigator |
齊藤 陽子 朝日大学, 歯学部, 教授 (30404487)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齊藤 一誠 朝日大学, 歯学部, 教授 (90404540)
高林 秀次 浜松医科大学, 光医学総合研究所, 准教授 (70372521)
佐藤 正宏 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, ゲノム医療研究部, リサーチアソシエイト (30287099)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 低ホスファターゼ症 / ALP / ゲノム編集 / モデルマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、独自開発の卵管内に存在する受精卵を標的としたゲノム編集技術（i-GONAD）を用いてアルカリホスファターゼ（TNSALP）遺伝子に変異を誘導することで、当該遺伝子の変異に起因する低ホスファターゼ症（HPP）様症状を呈するHPPモデルマウスを得ることができるか、このような変異マウスに正常型TNSALP遺伝子を有するHPP患者由来細胞を移植した場合、あるいは、正常型TNSALP遺伝子発現ベクターを遺伝子導入した場合、HPP様症状が緩和されるかどうかを検討することを目的とする。先ず、HPPモデルマウスを得るべく、TNSALP遺伝子の3’側に遺伝子欠損を誘導するためのCRISPR/Cas9系gRNAを2種設定し、これとCas9タンパクとが合わせた複合体（ゲノム編集液）を妊娠マウス卵管内に注入し、直ちに卵管全体に対し、in vivo electroporationをかけ、卵管内にある受精卵にゲノム編集液を導入させた。手術を受けたマウスはそのまま出産させた結果、生まれたマウスの~60%はTNSALP遺伝子に変異を示した。生後4週以上生存したTNSALP遺伝子に変異を持つマウスでは、いずれも片方のalleleに変異があったので、これから子孫を作り、ホモ個体を得た。ホモ個体は完全にTNSALP活性を失っており、すべて生後2週内で死亡。これは、既知の遺伝子標的法で得られたKOマウスと同じであった。現在、生後1週内のホモ新生仔の組織学的解析を実施中。他方、正常型TNSALP遺伝子を安定的に導入されたHPP患者由来細胞も得た。そのため、この細胞をTNSALP KO新生仔の顔面静脈経由で投入し、それによる個体の生存性延長、組織的損傷の修復程度などを確認する予定。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HPPは易骨折・呼吸不全などの全身的な問題だけでなく、嚥下・構音障害などの口腔機能の問題もあり、何より乳歯の早期脱落を契機に発覚する場合が多く、歯科が重要な役割を果たし得る疾患である。我々はこれまでHPPへの遺伝子治療を目指し、先天的にTNSALP活性が低下したHPP患者由来乳歯歯髄細胞（HDDPC）を用い、その特性を解析してきた。その結果、当該細胞は骨への分化誘導が不全だが、脂肪への分化は可能。しかし、正常型TNSALP発現ベクターの導入により、骨への分化誘導が可能となった。これは「TNSALPは主に細胞の骨分化に主要な働きを演じる」と解される。動物、特に、マウスでは遺伝子標的法で得られたTNSALP KOマウスは幾つか作製されたが、それが各ラボで自由に使える状況ではない。そこで、自前でそれを得るべく、独自開発の生体（卵管）内に存在する受精卵を標的としたゲノム編集技術i-GONADを用い、TNSALP遺伝子欠損マウス（TNSALP KOマウス）作製を試みた。その結果、B6, ICRからそれぞれ1系統得た。これら系統から得たホモ個体はいずれも完全にTNSALP活性を失っており、すべて出生後2週内で死亡した。これは、既知の遺伝子標的法で得られたKOマウスの表現型と同じであった。従って、本計画で示す「i-GONADで新たなHPPモデルマウスを作製する」という目標は達成できた。後は、これらマウスを用いて遺伝子治療、細胞移植療法の基礎的研究を遂行する段階となる。その準備段階として、細胞移植療法に必要なドナー細胞として、正常型TNSALP遺伝子を安定的に導入されたHPP患者由来細胞（蛍光遺伝子も導入）を得た。他方、遺伝子治療に必要なTNSALP遺伝子持続的発現のための遺伝子治療用ベクター（分泌型TNSALP発現プラスミドベクター）も構築が完了。よって、現在までの達成度は概ね順調と断ぜられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は自前で得たTNSALP KOマウスに対しての遺伝子治療、細胞移植療法の基礎的研究を遂行することとなる。遺伝子治療については、新生仔（ホモKO；生後~5日目）大腿筋内への分泌型TNSALP発現ベクター + EGFP蛍光遺伝子発現ベクターの注入、続く、注入部位へのin vivo EPを行う。筋肉組織は細胞分裂活性が低いので、導入されたプラスミドベクターは安定的に当該組織内に存在し、その結果、遺伝子（TNSALP、EGFP）発現が長期的に続くと予想される。筋肉組織で発現された分泌型TNSALPは血液循環を介し、体内の全ての組織に運ばれ、TNSALP欠損による代謝不全を解消。生後2週内で死亡する運命を乗り越え、個体は生存すると期待される。筋肉組織での遺伝子発現状況は、EGFP蛍光でモニターできる。また、体内でのTNSALP活性も生化学的に計測する。遺伝子治療後の生体組織での正常性への復帰は、主にその組織的解析から判断される。一方、細胞移植療法については、新生仔（ホモKO；生後~2,3日目）の顔面静脈（生後~2,3日目、一時的に皮膚表面に浮き出る）内へ正常型TNSALP遺伝子発現HPP患者由来細胞を注入する。その結果、当該細胞が血流に乗り、体内の様々な組織に運ばれ、移植細胞は定着すると予想される。それにより、TNSALP欠損による代謝不全は部分的に正常化し、生後2週内で死亡する運命を乗り越え、個体は生存すると期待される。移植細胞の局在状況は、EGFP蛍光でモニターできる。細胞移植を受けた個体の解析は、ほぼ遺伝子治療処理マウスの解析法に準じる。
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| Causes of Carryover |
2025年度はマウスへの生体内遺伝子導入実験や細胞移植実験、その解析の機会が増える見込みである。また、成果について学会発表、論文投稿を予定している。そのため、次年度使用額として翌年度分に助成金を持ち越した。持ち越した研究費は、組織学的解析のための外注費（切片作製）、分子生物学用試薬等の消耗品購入、学会参加費、出張費、論文校正、論文掲載費用として使用する予定である。
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