2023 Fiscal Year Research-status Report
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23K13843
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
村上 英太郎 大阪大学, 産業科学研究所, 特任研究員(常勤) (60963048)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | R-loop / 次世代シーケンシング / 塩基修飾 / 核酸化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
転写時に形成する二重鎖DNAの片方の鎖にRNA鎖がアニーリングしてできる3本鎖の核酸構造R-loopは、遺伝子発現における特徴的な構造因子として注目されている。異常な形成や修復酵素や低分子による摂動が、ゲノム不安定化や疾患の原因となることが示されている。一方で、ゲノムの形成箇所を調べたR-loopマッピングデータの検出感度や精度が不十分なため、「正常な」また「有害な」R-loopを定義することはできていない。R-loop研究を進展させるためには、高解像度なゲノムR-loop検出手法が必要である。本研究は「化学反応によるR-loopの核内検出方法」を確立し、R-loop形成領域の高解像度ゲノムマッピングを目指す。
本研究では、1. R-loop検出手法の確立、2. R-loop形成情報の獲得を実施し、研究期間内に化学反応によるR-loopの核内検出方法を確立する。本年度は、「1. R-loop検出手法の確立」における核内一本鎖DNAへの核酸塩基反応の探索の基盤となる、R-loopの一本鎖DNAのアデニン、グアニン、及びシトシンと反応する報告があるchloroacetaldehydeを用いた評価系の構築や人工的なR-loopの形成条件の検討を実施した。二本鎖領域及び一本鎖領域におけるchloroacetaldehydeの反応をHPLCで追跡し、反応後の安定性を二本鎖融解温度測定を用いて評価した。また、人工的なR-loopの形成条件を検討し、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動ではR-loopの形成が示唆される結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「1. R-loop検出手法の確立」で、核内一本鎖DNAへの核酸塩基反応の探索の基盤となる核酸に対する反応の評価系の構築と化学反応の対象となる人工的なR-loopの形成条件の検討を実施した。HPLCを用いてchloroacetaldehydeの二本鎖領域及び一本鎖領域への反応を追跡し、反応後の安定性を二本鎖融解温度測定により評価した。また、検討した条件下においてR-loopの形成が非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示唆された。さらに、一本鎖の塩基と反応可能な数十種類の反応剤を選定している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の成果を踏まえて、人工的なR-loopの形成を証明する。また、chloroacetaldehydeを用いて、検出に必要なqPCRストップアッセイやバイサルファイト法の条件を検討し、選定した反応剤の反応性を評価する。続いて、選定された反応剤の細胞核内における検出可能性を明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
条件検討に費やし、消耗品費用が予想以上に抑えられたため。
次年度は、国内外の学会参加の旅費、論文投稿や掲載料などに加えて、必要となる物品を購入する予定である。
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