光遺伝学を用いたクライオ電子顕微鏡画像におけるアクチン結合タンパク質の局在解析

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K14178
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 吉原 壮悟 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60963973)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: 細胞骨格 / クライオ電子線トモグラフィー / 光遺伝学 / アクチン

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は光遺伝学とクライオ電子線トモグラフィー(Cryo-ET)とを組み合わせたタイムラプスCryo-ET法により、細胞骨格ネットワークの経時的な構造変化および、それを制御しているアクチン結合タンパク質の局在をこれまでなかった解像度で明らかにすることである。本年度は、その基盤技術の確立および、その技術を用いた観察を目指し、研究計画に従い、以下の研究を行った。
アクチンネットワークを活性化させる光遺伝学ツールであるPA-Rac1導入海馬神経細胞へ青白光照射し、活性化時の様々なアクチン結合タンパク質の免疫染色により、クライオ電子線トモグラフィー観察に適したタンパク質の検討を行った。その結果、アクチン束化タンパク質であるα-actininおよびvinculinを候補として同定した。また、海馬神経細胞をグリッド上で培養、免疫染色および凍結した際にクライオ蛍光顕微鏡にて蛍光が観察されたため、Cryo-ET観察に応用できる可能性が高いことを確認した。今後、染色部位のCryo-ET観察を行い、アクチン束化タンパク質の機能解析を超微細レベルで行う。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

観察に適したアクチン結合タンパク質の同定およびグリッド上への細胞播種や凍結、光照射等の条件検討を終えたため、おおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

本年度に検討した条件を用いて透過型クライオ電顕Titan Kriosによるトモグラフィー撮影を行う。得られた画像はIMOD/Etomoを用いて立体構造を構築する。アクチン繊維の長さや配向、分岐などを3D 可視化解析ソフトウェアAmiraにて繊維解析ツールであるX-fiberを用い、解析する。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じたが、その金額は少なく、引き続き計画通りに研究を進展させる。