哺乳類特異的なヒストンバリアントH3.1の生理的意義と機能解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K14193
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 北川 紗帆 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 特任助教 (60965739)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: ヒストンバリアント / ヒストンH3 / クロマチン / CUT&Tag

Outline of Annual Research Achievements

H3.1の哺乳類独自の機能を明らかにするためには、ノックアウトマウスを用いた解析が必要である。しかしながら、H3.1遺伝子はマウスゲノムに複数コピー存在すること、また、H3.2と極めて高い塩基配列相同性(95%)を示すことから、特異的な遺伝子ノックアウトを行うことは非常に困難であった。本研究では、長鎖DNAベクターを用いて、65kbのクラスターとして存在する2つのH3.1を一度にH3.2に変換することで、ノックアウトマウス作成に用いる変異体ES細胞を効率よく作製する。ノックインに用いるDNAベクターは80kbと巨大であるが、Gibson assemblyおよびOriCiro cell cloning技術を駆使して、長鎖DNAベクターを作製した。 さらに、これらの長鎖DNAベクターをCRISPR/Cas9法によりマウスES細胞へ導入した。4つのH3.1遺伝子座を全てH3.2に変換するために合計3回のノックインを行う必要があるが、現在までに2回のノックインが完了している。得られたES細胞クローンの遺伝子型や核型を評価し、H3.1がH3.2に変換されたことを確認した。
また、H3.1のゲノムワイドな局在解析については、細胞株の作成に注力した。H3.1とH3.2を特異的に区別できる既存の抗体は存在しないため、内在性H3.1とH3.2 の発現を一挙にノックダウンした状態で、FLAGおよびALFAタグで標識したH3.1およびH3.2遺伝子を外来的に発現するES細胞を構築する。piggyBac法によりタグ標識および配列を改変したH3.1/H3.2遺伝子を導入した後、内在性H3.1とH3.2をノックダウンするためのshRNAレンチウイルスを細胞に導入することで、目的のES細胞クローンを取得した

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2023年度中に3回のノックインを完了できず顕著な成果が得られなかったが、全ての長鎖ドナーベクターの作成、また3回のうち2回のマウスES細胞へのノックインは完了しており、残り1回のノックインもこれまでの方法と同様に行うため、迅速に遅れを取り戻せる予定である。一方で、ゲノムワイドな局在解析については細胞株の取得が完了しており、本年度からゲノムワイドの局在解析に着手できる。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

2024年度は、残り1回のノックインを完了し、作成したH3.1変異ES細胞を用いて遺伝子改変マウスの作成に着手する。得られたH3.1変異型マウスと野生型マウスの表現型を比較することで、哺乳類個体におけるH3.1の生理的意義に迫る。
また、 ゲノムワイドな局在解析については、ペプチドタグに対する抗体を用いて CUT&Tag解析をおこない、H3.1とH3.2ののゲノムワイドな分布を明らかにする。