高齢者白血病治療における適切な治療を選別しうる新規診断法の確立

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K14719
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 山谷 琴子 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (90909805)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Keywords: 急性骨髄性白血病 / デシダビン / ベネトクラックス / 治療抵抗性

Outline of Annual Research Achievements

BCL2阻害剤ベネトクラクス（VEN）とDNAメチル基転移酵素阻害剤デシタビン（DEC）との併用療法はunfit患者に有望な治療効果を示したが、一部の患者では効果が限定的となり同治療に対する治療抵抗性が観察された。そこで、本研究ではVEN/DEC併用療法において治療抵抗性が生じる分子機構を解明し、治療効果識別マーカーを同定することを目的とする。
これまでの研究成果により、治療が奏効しない患者群と効果があった患者群の遺伝子発現とDNAメチル化のパターンを比較した結果、非奏効群ではエネルギー代謝に関連する遺伝子の活性化と免疫応答遺伝子の抑制が有意に観察された。特に、非奏効患者のAML細胞では、VEN/DEC治療後にペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（PPARG）がアップレギュレーションされていることが確認された。本年度は、単一細胞ATAC-seqを使用して、VEN/DEC治療抵抗性と関連するアクセシブルなクロマチンの変化をプロファイリングし、白血病関連クラスターにおいてPPARGモチーフが顕著に豊富であることを明らかにした。これの結果を基に、レンチウイルスベクターを使ってPPARGを高発現させる細胞株を作製し、その細胞のVEN/DECに対する感受性を検証したところ、PPARG高発現細胞は薬剤に対する感受性が低下していることが確認された。また、bisulfite pyrosequencingによるDNAメチル化解析から、DECによってPPARGが脱メチル化され、それが発現の亢進につながることも示された。最後に、細胞外フラックスアナライザーを使用した解析により、VEN/DEC投与時にPPARG高発現細胞では脂肪酸β酸化が亢進することが明らかになった。これらの研究成果は、VEN/DEC併用療法における治療抵抗性の分子機構を解明に寄与するものである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、BCL2阻害剤ベネトクラクス（VEN）とDNAメチル基転移酵素阻害剤デシタビン（DEC）の併用療法が特定の患者において有効であるものの、治療抵抗性を示す患者が存在することから、この治療抵抗性の分子機構を解明し、効果的な治療マーカーを同定することを目的としている。
今年度の主な進捗としては、単一細胞ATAC-seqを用いてVEN/DEC抵抗性に関連するアクセシブルなクロマチンの変化をプロファイリングした。再発AMLの患者から取得したサンプルと健康な対照群の骨髄細胞を使用し、合計23,803個の細胞をシーケンスした。データの初期処理はCell Rangerを使用し、細胞はUMAPによりクラスタリングされ、Azimuthアプリケーションを用いてアノテーションされた。白血病関連クラスターでは、他のクラスターと比較してPPARGモチーフが顕著に豊富であることが示された
次に、PPARGの上昇がVEN/DEC抵抗性と関連していることを確認するために、PPARGを過剰発現させた細胞株を用いて実験を行った。これにより、VEN/DECによる細胞増殖抑制とアポトーシス誘導が著しく減少した。さらに、bisulfite pyrosequencingによるDNAメチル化解析から、DECによってPPARGが脱メチル化され、それが発現の亢進につながることが示された。最後に、細胞外フラックスアナライザーを使用した解析から、VEN/DEC投与時にPPARG高発現細胞では脂肪酸β酸化が亢進し、エネルギー産生の変化が観察された。
これらの成果は、VEN/DEC併用療法における治療抵抗性の分子機構を明らかにする上で重要なステップであり、今後の研究に向けた新たな方向性を示すものである。研究は概ね計画通りに進行しており、引き続き治療抵抗性のメカニズムの解析を進めていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

本研究では、PPARGの高発現が白血病細胞の脂肪酸代謝に影響を与え、治療抵抗性に寄与していることを仮説として提案している。すでにExtracellular Flux Analyserを用いて、内因性の脂肪酸β酸化の亢進が確認されたが、外因性の脂肪酸代謝に関する解析は現在進行中である。今後はこの部分の研究を進める予定である。さらに、質量分析を使用して脂肪酸代謝物の変化を調べることも検討している。
また、デシタビンによる内在性レトルウイルス（ERV）の再活性化が模倣ウイルス感染状態や腫瘍関連抗原を生み出し抗腫瘍免疫応答を引き起こすことが知られている。Bulk RNA sequencingで見出された「非奏効グループでの免疫応答関連遺伝子群の減弱」という発見に立脚し、患者検体のSingle cell解析を実施することによって白血病細胞および免疫細胞 （T細胞、NK細胞）での活性化遺伝子発現を検出・検証し、免疫細胞を含むAML微小環境にも視点を置き解析する予定である。

Causes of Carryover

今年度は予定よりも高額な実験費が必要となり、また円安の影響で国際学会に出席する渡航費、滞在費、学会費が高騰していることから前倒し請求を行った。そのため、残額を次年度使用額として計上する。

Research Products

• [Presentation] PPARG and ASS1: Targets of metabolic alteration in Venetoclax / Decitabine resistant AML (2023)
  • Author(s): Kotoko Yamatani, Tatsuro Watanabe, Kaori Saito1, Abhishek Maiti, Satoshi Yamashita, Abdullah Khasawneh, Faith Jessica Paran, Kala Hayes, Gautam Borthakur, Joe R Harman, Shinya Kimura, Courtney D. DiNardo, Thomas A Milne, Michael Andreeff, Yoko Tabe, Marina Konopleva
  • Organizer: 65th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Int'l Joint Research