2023 Fiscal Year Research-status Report

尿毒症状態における免疫障害に対するMg負荷の効果に関する研究

Research Project

Project/Area Number	23K15253
Research Institution	Wakayama Medical University
Principal Investigator	田中佑典和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00612110)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Keywords	Klotho / Mg
Outline of Annual Research Achievements	初年度として、FACS手技、Western Blot手技のプロトコル作成を行う方針とした。令和6年度実施予定であったマウスリンパ腫由来細胞株であるA20を用いて尿毒症状態におけるKLOTHOの変化を確認するために患者血清を添加し培養実施した。過去の論文の再現性を確認すべく（ Immun Inflamm Dis. 2020 Jun; 8(2): 228-235. ）、健常人血清、透析患者血清を添加した培地でA20細胞を培養し、FACSで解析を行い、 cleavage of klotho indexの測定を行い再現性を確認した。その際、蛍光強度に有意な変化をつけることができなかった。次に、予備実験として1度の実験で必要血清量を把握するため当講座で冷凍保存していたマウス血清、ラット血清を用いて、KLOTHOの蛍光強度の変化を確認したが、同様にKLOTHOの蛍光強度に変化をつけることができなかった。上記に伴い、FACSにおいて有意な変化を認める実験条件の設定に難渋している。その他の方法で評価が可能かを確認するために、過去の実験の再現性確認のため、健常人血清、透析患者血清での培養、追加でFBSでの通常培養、通常マウス血清、腎不全モデルマウス血清、通常ラット血清、腎不全モデルラット血清を用いてA20細胞を培養し、24時間培養実施後の上清をウエスタンブロッティング実施し、上清中のKLOTHOを確認した。 in vitroでの変化を捉えることができていないため、in vivoにおけるマウス臓器での発現を確認した。脾細胞において、KLOTHO, FGFR1, FGFR4, FGF23 の発現を確認している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 予備実験として過去の再現性を確認したが、再現が得られず、各実験手技における実験条件の設定に難渋している。各血清によるKLOTHOの変化に対して、Mg添加によりどのような影響を及ぼすのかを検討する仮説であるが、FACSにおける蛍光強度評価については、現段階でプロトコルを再検討中である。マウスリンパ腫由来細胞株であるA20においてKLOTHOが発現していることはWestern Blot、ｑPCRを用いて確認を行ない発現を認めていることは確認できているが、FACSにおけるKLOTHOの蛍光強度評価：（cleavage of klotho index）については血清間において有意な変化を認めていないため、KLOTHOの変化をどのように捉えるかを検討中である。マウスリンパ腫由来細胞株であるA20において、腎不全血清でA20細胞表面のKLOTHOが切断されることを確認のため、各血清添加培地で培養を行なった上清をWestern Blot実施したが、有意なバンド認めなかった。その際、培養したA20細胞には KLOTHO発現していることを確認するため、ウエスタンブロッティング実施したところ、各種血清添加で培養したA20細胞ではKLOTHOのバンドが確認できた。そのうちで健常人血清でバンドが濃く出ていることが判明している。
Strategy for Future Research Activity	KLOTHOの変化を確認する適切な実験条件が定まっておらず、調整中である。 In vitroにおいてマウスリンパ腫由来細胞株であるA20に対してTNF-αなどを直接作用させて、KLOTHOの変化を評価する実験条件を設定し、それを踏まえてMg濃度の変化によるKLOTHOの変化について検討を行う。上記が困難な場合は、マウス、ラットの臓器においてKLOTHOの発現を捉えることができるのであればin vivoにおいて、腎不全モデルマウスを作成し、アデニン食、低マグネシウムアデニン食、高マグネシウムアデニン食を作成し、8週間飼育、解剖し、脾細胞でのKLOTHOの発現に変化を認めるかを検討予定である。また、腎不全モデルマウスラットを作成し、腎不全状態がリンパ球に及ぼす影響およびMg欠乏や負荷に生じる影響を観察する予定である。
Causes of Carryover	過去実験の再現が得られておらず、FACSにおいて腎不全モデル血清を用いての評価を遂行するための最適な実験条件が確定していないため、ラットの腎不全モデル作成予定であったが、保存血清において、FACSでのKLOTHO蛍光強度に変化を認めておらず、マウス、ラットどちらの生物種が実験に適しているか評価ができていないため、動物の飼育が行えていないことで、初年度の動物飼育を行なっておらず研究費の次年度使用が発生した。FACSやWestern Blotについて実験条件を十分検討し設定後、ラットを飼育するかマウスを飼育するかを決定し、血清の確保を行う。また、上記に合わせて、令和5年度実施予定であったアデニン誘発腎不全モデル動物を用いて腎不全状態が、動物の生体内のリンパ球に及ぼす影響およびMg欠乏や負荷時に生じる影響を観察予定である。