多能性幹細胞から前庭有毛細胞の特異的分化誘導と培養前庭による細胞移植再生の試み

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K15892
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 阪上 雅治 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (50745437)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: 前庭有毛細胞 / 分化誘導 / ES細胞 / 再生

Outline of Annual Research Achievements

急性的な前庭機能障害による臨床症状は、中枢での代償機構により症状が緩和されるが、高度前庭障害では、前庭代償不全によるめまい・歩行障害などの症状が持続するにも関わらず、 根本治療は未だ存在せず、その確立が急務であると考えられる。近年、多能性幹細胞（ES細胞やiPS細胞）を用いた再生医療の基礎研究が国内外で報告され（Sasai, Nature 2013; Takebe et al, Cell Stem Cell, 2015など）、それらの臨床的展開として、眼科・神経領域などの分野で、急速な臨床応用が先行している。内耳領域でも、多能性幹細胞より内耳有毛細胞への分化誘導が開発され（Koehler et. al., Nature, 2013など）、 高度前庭障害に対する有毛細胞移植が新規治療法の一つとして期待されるが、前庭有毛細胞特異的分化誘導に着目した研究は殆ど行われていない。先行研究として、前庭有毛細胞への分化誘導（液性）因子を発現すると考えられた前庭由来細胞（VC）の培養上清を用いて、内耳前庭有毛細胞を選択的に創生することが可能な方法を報告した（Sakagami et al., BBRep, 2019）。そこで本年度は、選択的前庭有毛細胞分化に寄与する分泌性タンパク因子を同定し、前庭有毛細胞の選択的分化誘導法を開発することを目的とした。
出生直後のマウス（C57BL/6）より内耳を単離し、 前庭および蝸牛を分離後、前庭細胞（VC）および蝸牛細胞（CC）を培養した。VCおよびCCよりRNAを抽出後、RNA‐seqにより前庭／蝸牛における特異的遺伝子発現パターンを解析した。VCではCCと比較し502の遺伝子が亢進しており、クラスタリング解析の結果からは、細胞外マトリックス関連経路が分泌性因子として関与していることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画に基づき期待した実験成果が得られているため。

Strategy for Future Research Activity

VC特異的遺伝子（群）のcDNAを、VCより作成した遺伝子発現ライブラリーを用いて増幅さ
せ、動物細胞発現ベクターへのサブクローニングを行い、分泌性発現ベクターの構築を行う。種々のVC特異的遺伝子を293細胞株に遺伝子導入し、G418による薬剤耐性株により安定発現細胞株を樹立後、Expi293 Expression Systemを用いて、VC特異的分泌タンパク質（VP）を回収・精製する予定である。

Causes of Carryover

消耗品として計上していた試薬等を必要最小限で抑えれたことにより、次年度以降の実験に必要な物品を計画的に購入することで、研究を遂行する。