2023 Fiscal Year Research-status Report
独自のメタゲノムデータに基づく新規CRISRP-Cas系の機能構造解析と探索
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23K17995
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
松本 俊介 九州大学, 農学研究院, 助教 (70704295)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas / ゲノム編集 / メタゲノム / 耐熱性 / 小型Cas |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR/Casシステムに基づくゲノム編集は、現在広く利用されているが、医療・産業分野では課題があり、国産のゲノム編集技術が強く望まれている。われわれは独自に、環境サンプルからDNAを調製して、メタゲノムを解析し、新規なCRISPR-Cas系エフェクターを探索してきた。これまでに温泉水のメタゲノム解析からユニークな配列を持つCas9とCas12a、そして日本海洋のメタゲノム解析から小型のCasタンパク質（ミニチュアCas）を10個（便宜的にMiniture Cas Candidate(MMC)1-10と呼ぶ）発見した。本研究はこれら新規なCasエフェクター候補の機能構造を解析すると共に、新たにメタゲノム解析を行い、機能未知なCasタンパク質を探索することで、ゲノム編集ツールの幅を広げる技術開発を目指している。現在までに、温泉サンプルに由来するCas9とCas12aは、高い熱安定性を示し、広範な温度域で標的DNAを切断する新規な耐熱性Casタンパク質であることを明らかにした。次に、海水サンプルに由来する2つの候補タンパク質MMC1、MMC2が、crRNA依存的に標的DNAを切断する新規な小型Casタンパク質であることを明らかにした。クライオ電子顕微鏡を用いて、これらのCasタンパク質とガイドRNA、標的DNAとの三者複合体の立体構造を決定し、Casタンパク質による核酸の分子認識と標的DNA切断のメカニズムを明らかにした。これらのCasタンパク質のゲノム編集ツールとしての有用性を調べるため、現在、大腸菌と出芽酵母を用いた解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでにプラスミドライブラリーを用いたin vitro系によって、Cas9、Cas12aそして小型Cas候補タンパク質MMC1、MMC2が認識するProtospacer Adjacent Motif（PAM）を決定することができ、プラスミドDNAを基質とした標的DNA切断系を確立することができた。クライオ電子顕微鏡解析により、Cas9については、sgRNAとの二者複合体とRループの長さが異なる4つの三者複合体の立体構造を決定し、sgRNA、PAMの認識機構そしてRループの伸長に伴ったCas9の構造変化が明らかとなった。Cas12aについては、crRNA-標的DNA三者複合体の立体構造を決定し、crRNA、PAMそして標的DNAの認識機構が明らかとなった。MMC1については、crRNAとの二者複合体、そしてcrRNA、標的DNAとの三者複合体の立体構造を決定することに成功した。MMC2については、crRNA、標的DNAとの三者複合体の立体構造を決定した。構造解析の結果、MMC1およびMMC2によるcrRNA、PAMそして標的DNAの認識に関わるアミノ酸残基を特定し、変異体実験によって、これらのアミノ酸残基の重要性を検証した。大腸菌細胞内で、Cas9、Cas12a、MMC1、MMC2をCRISPRアレイと共発現させ、ゲノムの切断活性を評価した。MMC1については、大腸菌のゲノムを切断する結果が得られたが、Cas9とCas12aそしてMMC2については、大腸菌の生育に影響は見られなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cas9、Cas12aそしてMMC2は、大腸菌細胞内でゲノムDNAの切断活性が検出されなかった。これには、crRNA前駆体のプロセシングや大腸菌の増殖温度37度におけるCasタンパク質のDNA切断活性の低さが影響している可能性がある。そこで、リボザイムを利用したcrRNAの産生系を検討する、そして構造情報をもとに、標的DNA結合部位を変異を入れるなど改変を行い、高活性なCasタンパク質をスクリーニングすることを計画している。MMC1については、出芽酵母や培養細胞で発現させ、実際にゲノム編集できるのか解析を行う。有明海のメタゲノム解析から発見したMMC3については、大腸菌細胞内で推定CRISPRアレイと共発現させるとRNAが結合した複合体として、精製できることを見いだした。今後は、MMC3に結合したRNAをNGS解析によって配列を同定する。そして、PAMの決定を行い、標的DNA切断活性が検出されるのか、検討する。
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Research Products
(4 results)
