2023 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
23K18114
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
今田 勝巳 大阪大学, 大学院理学研究科, 教授 (40346143)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上野 博史 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 講師 (10546592)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
|
| Keywords | 分子モーター / イオンチャネル / イオン駆動力 / エネルギー変換 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞はイオン駆動力（IMF）をエネルギー源として、運動・物質輸送・ATP合成など様々な生命活動を行なっている。IMFで作動する代表的な分子装置であり、細菌の運動機関であるべん毛モーターは、回転子とイオンチャネルである固定子からなる。最近、固定子主要部のクライオ電子顕微鏡構造構造から固定子自体がIMFで駆動する新規のイオンチャネル型回転モーターである可能性が示唆された。そこで本研究では、固定子の回転を計測する系を構築し、回転の実証と固定子モーターの特性や作動機構の解明を目指している。今年度の実績は以下の通りである。
１）コンストラクトの作成と固定子の発現：固定子が常時活性化状態にある変異体が存在し、プロトンで作動するサルモネラ属菌固定子へのビオチンラベルの導入に成功した。アビタグ配列をBサブユニットのペリプラズムドメインに導入した固定子およびBサブユニットの膜貫通領域にロイシンジッパーとアビタグを導入して剛直化した固定子を発現するコンストラクトを作成し、発現を確認した。また、これら固定子が内因性BirAによりビオチンでラベルされていることを確認した。
２）ストレプトアビジンによる修飾：ビオチン化固定子を発現する菌体からスフェロプラストに外から加えたストレプトアビジンが結合することを蛍光ストレプトアビジンを用いて確認した。
３）スフェロプラストの基板への固定：スフェロプラストのガラス基板への吸着効率を高めるため、His-tag付き1回膜貫通蛋白質FliLをラベル化固定子と共発現する系を構築した。
４）ナトリウム型固定子の計測系の構築に備え、ナトリウム駆動型固定子のクライオ電子顕微鏡構造解析を進めた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2023年度までに、サルモネラ属菌を用いて２種類のアビタグ配列を有する固定子を発現する系の構築に成功した。これらは、内在性BirAでビオチン化されていたことから、ビオチン化のステップを省略することができた。また、ビオチン化固定子を発現する菌体から作成したスフェロプラストにストレプトアビジンが結合したことから、固定子へのラベル導入が可能であることを実証できた。現在の問題は、多数のスフェロプラストを基板へ固定することである。ストレプトアビジン化した基板では吸着固定の効率が悪かったため、Ni化した基板に吸着固定させる系の構築を進めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は以下の項目を進める
１）His-tag付き1回膜貫通蛋白質FliLをラベル化固定子と共発現した菌体を用いてNi化基板に効率よく吸着固定させる系を確立する。吸着効率が上がれば、ストレプトアビジンを介した金コロイドラベルを行い、顕微鏡で観察する。
２）スフェロプラストでうまくいかない場合に備え、アビタグとHis-tagを有する固定子を用いて固定子を精製し、リポソームへの再構成を行う。
３）ナトリウムで駆動するキメラ固定子にラベルを導入した系を構築する。
|
| Causes of Carryover |
差額が生じた理由は、スフェロプラストの精製・濃縮への使用を予定していた限外濾過型濃縮装置の導入を試用結果に基づいて見送ったこと、およびラベル化した固定子を発現するスフェロプラストの基板への吸着固定効率が予想以上に悪かったため、その解決を優先したことにより計測に必要な物品の購入費や分担者との行き来に必要な旅費に差額が生じたことによる。基板への固定に目処がつきつつあるため、これらは次年度に使用する予定である。また、スフェロプラストの精製・濃縮は別方法で実施するための器具・消耗品の購入に使用する予定である。
|
Research Products
(4 results)
