Analysis of the mechanism of gut homeostasis using organ-on-a-chip

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23K18200
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 奥村 龍 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (00793449)
• Project Period (FY): 2023-06-30 – 2026-03-31
• Keywords: 腸管恒常性維持機構 / 生体機能チップ / 腸管上皮バリア

Outline of Annual Research Achievements

・ミニ腸管作製用マイクロデバイスの作製
山口大学医学部システムズ再生・病態医化学の清木誠教授、徳永雅之助教の指導の下、2D-CADソフトを用いて設計・作製したSU-8モールドに液状のポリジメチルシロキサン（PDMS）を流し込み、PDMS硬化後モールドから剥離することで、マイクロ流路PDMSデバイスを作製した。作成したPDMSデバイスとガラスボトムディッシュの表面をプラズマ処理し、両者を接着させた後、PDMSデバイスの流路よりコラーゲンマトリゲルをデバイス内のチャンバーに充填し、京都大学ヒト生物学高等研究拠点（ASHBi）に設置されているZeiss Microbeamのレーザーを用いて、上記のマトリゲル内に腸管腔、腸陰窩を模した流路を形成した。作成した流路に培地を流入し、流路が開通していることを確認した。今後は正常マウスおよびヒト腸オルガノイドの上皮細胞を培地とともにマイクロデバイスの腸管腔・腸陰窩流路に播種し、マイクロデバイス上での腸管上皮細胞の培養を行う。
・腸粘液モニターマウスの作製
ミニ腸管作製後にミニ腸管における粘液をモニターするため、腸管ムチンであるMuc2遺伝子のC末端にGSリンカー配列、蛍光タンパクであるmCherry配列を挿入したマウス（Muc2-GS-mCherry）をCRISPR-Cas9システムを用いて作製した。現在目的遺伝子座に、GS配列、mCherry配列が挿入されていることを確認している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

PDMSマイクロデバイスの作製、腸粘液モニターマウスの作製は完了しており、当初の予定通り研究は進行していると考える。

Strategy for Future Research Activity

作製したマイクロデバイス上で正常マウスおよびヒト腸オルガノイド由来の上皮細胞を培養し、マイクロデバイス上での腸管上皮細胞の定着を確認する。さらに粘液の分泌を確認するため、粘液モニターマウス（Muc2-GS-ｍCherryマウス）の腸オルガノイドを用いて同様の実験をを行い、マイクロデバイス上で正常の粘液層が形成される培養条件を検討する。さらにマイクロデバイス上での腸管上皮細胞の定着、粘液層形成を確認後、腸内細菌、免疫細胞、間質系細胞を播種し、正常ミニ腸管の作製を行う。正常ミニ腸管の作製に成功した後、デキストラン硫酸ナトリウムや腸炎モデルマウスの細胞を用いて、炎症性腸疾患（IBD）ミニ腸管の作製を検討する。

Causes of Carryover

出張旅費が想定以上に減額したため、67,682円の次年度使用額が発生した。この繰越助成金は、翌年度分の助成金と合わせて、ミニ腸管作製に必要である腸オルガノイドの培養試薬、シングルセルRNAシークエンシング解析等に使用する予定である。