2023 Fiscal Year Research-status Report
Study of a novel regulatory mechanism of peptidoglycan degradation by the Clostridium perfringens autolysin Acp
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23K18227
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| Research Institution | Matsuyama University |
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Principal Investigator |
玉井 栄治 松山大学, 薬学部, 教授 (40333512)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神鳥 成弘 香川大学, 医学部, 教授 (00262246)
美間 健彦 愛媛県立医療技術大学, 保健科学部, 教授 (80596437)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| Keywords | Autolysin / グルコサミニダーゼ / 細胞壁 / ペプチドグリカン / 制御機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細菌の形態を維持するために必須である細胞壁（ペプチドグリカン）の再構成におけるAutolysinによるペプチドグリカン分解制御機構をウエルシュ菌のAutolysin (Acp)を用いてタンパク質レベルで明らかにするものである。Acpは、N末端に10個の細胞壁結合ドメイン（CWBD）とC末端にグルコサミニダーゼドメインを持つAutolysinである。まず、10個のCWBDに関して様々な変異体を発現するベクターを構築しCWBDの数による細胞壁再構築に与える影響を調べることを目的とした。今回、構築したベクターが発現するAcpのCWBD変異体は、10個あるCWBDのうち、N末端から１個ずつ欠損させたもの（９種）と1個ずつ持つもの（5種）、その他2から5個のCWBD（10種）を持つものである。構築したプラスミドをAcp欠損ウエルシュ菌に導入し、野生型及び変異型Acpの発現を誘導し各種解析を行った。Western blotting及びZymographyを行った結果、全ての変異体において発現が確認され、細胞壁分解活性を有していることがわかった。なお、一部変異体においては様々な分解産物も見られたことより、変異体によっては安定性が異なることが予想された。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用いて菌の形態とAcp変異体の局在を調べた。CWBDを持たないAcp（AcpCD）を発現する変異体では、菌体が長くなっており、Acpの局在も見られなかった。CWBDを1つもしくは2つ持つAcp変異体では菌体がCWBDを持たないものに比べ短くなっていたが、明らかな局在は見られなかった。さらに、CWBDを3個以上持つ変異体においては、さらに菌体が短くなり、菌のセプタと両端に明らかに局在していることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウエルシュ菌のAutolysinであるAcpに関して、ペプチドグリカン分解制御機構に対するCWBDの影響を調べるため、24種類の変異体を発現するベクターの構築ができた。さらに、これらをAcp遺伝子欠損ウエルシュ菌に導入し、その発現や細胞壁分解活性を確認するとともに、菌の形態および変異Acpの局在を明らかにした。これらの実験は、2023年度に予定していた実験であるため進歩状況としてほぼ予定通り進行していると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
AcpのCWBDに関して、ペプチドグリカンとのドッキングモデルをin silicoで構築を行い、結合に関与するアミノ酸を予想する。さらに、予想されたアミノ酸を変異させたAcpを作成し、結合活性を測定し、結合に関与するアミノ酸を同定する。一方でCWBDは、そのアミノ酸配列により5種類に分けられる。6番目のCWBDは、NMRによりその構造が決定されているが、アミノ酸配列の異なる1、２，３、１０番目のCWBDは、構造予測の段階である。したがって、これら構造未決定のCWBDに関しても構造を決定する。
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| Causes of Carryover |
在庫が少なくなっていたテストチューブを1月に発注を行ったが、在庫がなく納期が4月以降になったため。
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