2020 Fiscal Year Annual Research Report
Structural analysis of polyketide synthase using cross-linking reaction
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20H02911
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
宮永 顕正 東京工業大学, 理学院, 助教 (10623126)
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2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 微生物酵素 / 結晶構造解析 / タンパク質間相互作用 / クロスリンク / ポリケタイド / ポリケタイド合成酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モジュラー型ポリケタイド合成酵素 (PKS) の反応において、ケト合成酵素 (KS) ドメインは上流モジュールのキャリアータンパク質 (CP) から伸長過程のポリケタイド鎖を受け取り、同一モジュール内のCPに結合したマロニル型アシル基質との縮合反応を触媒する。このように、KSドメインは反応過程で2種類のCPを認識すると考えられ、それぞれのCP認識機構に興味がもたれる。
今年度は上流モジュールのCPとKSとの相互作用解析を行った。まず、ビセニスタチン生合成に関わる様々なCPドメインを用いてVinP2PKSのKSドメインに対するアシル基の受け渡し活性を評価した。その結果、本来の組み合わせであるVinP1PKSのCPドメインからは効率よくアシル基が受け渡されたのに対し、他のCPドメインからはアシル基がほとんど受け渡されなかったことから、上流モジュールのCPとKSの間に特異的な相互作用が存在することがわかった。次に、上流モジュールのCPとKSの複合体構造解析を目指し、クロスリンク反応を利用し、構造解析に適した安定な複合体を生成させることを検討した。以前に設計したパンテテインアミドプローブを用いて上流モジュールのCPドメインを修飾したのちにKSドメインを混合したところ、これらのクロスリンク複合体が特異的に得られることがわかった。現在、得られた複合体を精製し、結晶化の検討を行っている。また、得られたクロスリンク複合体のクライオ電子顕微鏡データも収集しており、現在、データ解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CPドメインとKSドメインの複合体の構造解析を行うことを目的として、まず、結晶構造解析に適した安定な複合体を得るため、クロスリンク反応を検討した。その結果、CPドメインとKSドメインとの間で効率よくクロスリンク反応が進行する条件を見出し、これらの複合体を精製することができた。現在、精製した複合体の結晶化検討を行っている段階であり、ほぼ当初の計画通りであることから、順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きKSドメインとCPドメインのクロスリンク複合体の結晶化を検討し、結晶が得られれば構造解析を行い、CP認識機構を明らかにする。また、その他の触媒ドメインとCPの複合体についてもクロスリンク反応を検討し、クロスリンク複合体が得られれば、結晶化を検討する。得られた成果について、学会発表や論文発表を行う。
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