2021 Fiscal Year Annual Research Report
Pathophysiology of bone disorder in light of epigenetic alteration and comprehensive network of transcription factors
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20H03458
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
北澤 荘平 愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (90186239)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北澤 理子 愛媛大学, 医学部附属病院, 准教授 (00273780)
原口 竜摩 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (00423690)
小原 幸弘 愛媛大学, 医学系研究科, 助教 (50792214)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 骨芽細胞 / 破骨細胞 / RANKL / メチル化DNA / TATAボックス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度では、これまでに若齢と高齢マウスの骨組織比較によるRANKL発現細胞局在検討をおこない、若齢マウスと高齢マウス個体の骨量測定を行い、RANKL発現細胞の量と分布の加齢変化について組織学的評価を行った。RANKL発現を示すGFP分布を、骨芽細胞系（Runx2, Osterix）、骨細胞（DMP-1, Sclerostin）形質の螢光免疫染色に重ね、RANKL発現細胞を同定した。一部のマウスでは、GFP螢光強度が十分でなく評価困難であったが、光顕的な二重免疫染色、in situ hybridization法の併用にて対応できた。TATA-box上流の1塩基置換マウスとの交配によるCpGメチル化機能解析を行った。一塩基変異導入により、マウス個体の表現形は多少の揺らぎ減少が認められ、骨量の増加したものと逆に減少したものとが認められた。この現象を確認するために、同腹マウスでの解析を加えたところ、一塩基変異導入では全般的には骨量の減少が認められ、当初の予想通りの結果を得ることが出来た。このマウスは、MeCP2結合配列であるTATA-box直上のCpG部位を遺伝子編集によりGpG配列に置き換えた改変マウスで、H31年度に筑波大学と共同開発した。このpin-pointのメチル化によって、マウス頭蓋冠由来の一次培養骨芽細胞や骨髄組織ex vivo培養細胞でのRANKL発現の推移を評価すとともに、RANKL発現をの蛍光物質で評価するノックインマウスと交配し、経時的なEGFP蛍光強度の変化を評価している。リアルタイムPCR穂での定量へと進んでおり、下流域でのエストロゲン作用を示唆する新たな知見も得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
コロナでの研究停止や施設への立ち入りが困難になった期間もあったが、原口共同研究者の尽力で、動物の作成、交配が順調に進み研究への大きな使用が出なかったことによる。
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| Strategy for Future Research Activity |
特定の形態学的変化を病理診断の指標とすることについての合理性の評価、エピジェネティクスを標的とした癌の新たな早期診断法と治療戦略の基礎を確立することを目的として検討を継続する。とくに、糖尿病・生活習慣病などによる酸化的ストレスと非定型的DNAのメチル化との関連について以下のような検討を行う予定である。代謝毒のin vitro実験系として、ST2細胞にメチルグリオキサール（MG）投与を行い、p16INK4a, RANKL増加/ Wnt signal低下という老化促進phenotypeが、MeCP2結合阻害による新規のエピジェネティクス機構によりもたらされることを確認する。特にWnt系（骨形成）の阻害分子であるsFRP4遺伝子を再活性化する分子機構として、TATA-box近傍CpGへの8OH-dG付加が、メチル化によるpin-point抑制を解除することを分子レベルで検討する。8OH-dGは酸化的ストレスによる核のDNA修飾のひとつであり、前項1）の時間的加齢によるCpGメチル化はRANKL遺伝子を不活化するが、酸化的ストレスによる8OH-dG付加はこれを解除することを想定している。骨芽細胞ST2, 骨細胞へのMG投与の効果をアレイ解析で包括的に検討し、変化する特定の遺伝子発現をRT-PCRにて確認することを予定している。
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Research Products
(4 results)
