2021 Fiscal Year Annual Research Report
Spectroscopy basis for elucidating mechanims of allosteric ligand recognition in GPCR
| Project/Area Number |
21H01883
|
|---|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
片山 耕大 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (00799182)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | GPCR / アロステリックリガンド / 赤外分光法 / 分子振動 / シグナル伝達 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、赤外分光法を創薬の標的分子として重要なGPCRに適用し、リガンド結合に伴う化学的相互作用の変化を分子振動の変化として捉えることで、①アロステリックサイト (結合機構) と②結合に伴う受容体の構造変化 (作用機序) に関する原子レベルの構造情報を取得する。さらに、③リガンドによって活性化したGPCRと結合するシグナル伝達因子との結合機構を明らかにする。これにより、アロステリックリガンドによるGPCRの活性制御機構の解明に挑む。
今年度は、ムスカリン性アセチルコリン受容体 (M2R) 選択的なネガティブアロステリックモジュレーター (NAM) であるアルクロニウムを用いることで、赤外分光法によるM2Rに対するアロステリック効果を観測できるかどうかを検証した。具体的には、M2Rへのアゴニストおよびアンタゴニスト存在下でのアルクロニウム結合実験によるスペクトル測定を実施した。その結果、アルクロニウム結合に伴い、アゴニストについては受容体からの解離によるスペクトル強度の減少、アンタゴニストについては、スペクトル強度の増加が観測された。これらの結果は、アルクロニウムのNAMとしての機能が発揮されたことを強く示しており、GPCRの赤外分光計測手法がアロステリック効果を捉えることができることを実証した。
の井上飛鳥准教授との共同研究により、赤外分光法でM2Rに対する、異なる薬剤効能を有する各種薬物結合に伴う構造変化を捉えることに成功し、Communications Biology誌に発表した。さらに本研究は従来の構造ベースの薬物結合ポケットを基盤とした薬剤設計指針とは異なる、相互作用解析から動的構造情報を抽出し薬効度を制御する新たな薬剤設計指針を提示できると期待され、日本経済新聞に取り上げられた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、M2Rを研究対象として、赤外分光法を中心とした構造解析を行い、物理化学的な観点からGPCRのアロステリックリガンド結合機構、作用機序、そしてアロステリックリガンドによって制御されるGタンパク質やアレスチンを介したGPCRのシグナル伝達機構を明らかにすることを目指している。一方、これまで申請者が行ってきたリガンドとの相互作用解析では、2液交換系を利用してきたが、オルソステリックリガンド (アゴニスト、アンタゴニスト) 存在下でのアロステリックリガンドとの結合実験を実施するためには、3液交換系を確立する必要があった。さらに、得られる赤外スペクトル上には受容体の構造変化のみならず、2種類のリガンド自身の変化情報も含まれるため、スペクトルから目的の構造変化を抽出することが複雑化する。今回、溶液交換用の流路の改変・工夫を施すことで、3液交換系を組み合わせた赤外分光測定を可能にした。さらに、オルソステリックリガンドの濃度依存実験を行うことで、受容体、オルソステリックリガンド、そしてアロステリックリガンド由来の赤外吸収バンドを分離し、目的の構造変化情報を抽出した。これらの試行錯誤の結果、赤外分光計測手法によりGPCRのアロステリック効果を検証することを可能にした。今後、赤外吸収バンドの帰属やアロステリックリガンドの濃度依存性、NAMのみならずポジティブアロステリックモジュレーター (PAM) に対しても同様の測定を実行することで、アロステリックリガンド結合機構および作用機序を明らかにする。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今年度、測定系の改良を行うことで、M2Rに対しNAMによるアロステリック効果を赤外差スペクトルとして抽出することに成功した。そこで今後同様の測定をPAMに適用することでアロステリックリガンドの結合機構や作用機序の解明を目指す。さらに、シグナル伝達因子 (Gタンパク質/アレスチン) との結合機構、活性機構を明らかにするべく、すでに大腸菌を用いたGタンパク質の発現・精製にも取り組んでいる。今後、精製したGタンパク質を用いた結合実験も遂行していく。
|
