2022 Fiscal Year Annual Research Report
翻訳停滞解消因子YaeJの生理的役割と反応機構の解明
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21H02113
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
栗田 大輔 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (60552651)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
葛西 秋宅 弘前大学, 医学研究科, 助教 (20609664)
行木 信一 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (80302959)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | リボソーム / YaeJ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、YaeJによるリボソームレスキュー機構の分子メカニズムを明らかにするために、YaeJ/リボソーム複合体に対して、機能解析および構造解析を行うものである。令和4年度は部位特異的ラジカルプロービングを中心に進めた。システインを導入したYaeJ変異体を多数作製し、in vitroでペプチジルtRNA加水分解の活性を確認した。多くの変異体について野生型YaeJと同等の活性を有していることを確認した。次にin vitroで翻訳停滞リボソームに対するプロービングを行った。その結果YaeJのリボソーム上での結合位置を特定することに成功した。また、ペプチジルtRNAの活性が低下した変異体について、バイオレイヤー干渉法によってリボソームへの結合活性を評価した。その結果、YaeJのC末端の塩基性アミノ酸に変異を導入すると、野生型YaeJと比べて解離定数Kdが30倍以上上昇しており、リボソームへの結合活性の低下が見られた。前年度にリボソーム関連遺伝子の欠損株に由来するリボソームについて、YaeJのリボソームへの結合には影響しないがペプチジルtRNA加水分解活性を低下させることを発見した。このリボソームに対してYaeJのラジカルプロービングを行ったところ、ラジカルプロービングのパターンに変化が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラジカルプロービングによる複合体解析は順調に進んでいる。ラジカルによる切断を示す変異体が期待していたよりも少なく、当初の予定より多くの変異体を追加で作製することになったが、大きな遅延とはならなかった。バイオレイヤー干渉法も測定のノウハウが蓄積し、安定的にデータを得られるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、YaeJによるリボソームレスキューシステムの細胞内における役割と分子メカニズムを明らかにするために、YaeJの構造解析および機能解析、YaeJの標的産物の解析を行っていく。予定していたラジカルプロービングの実験はほぼ終えることができたので、YaeJ/リボソーム複合体の中間体の解析に移行する。さらにバイオレイヤー干渉法を用いて他のリボソームレスキュー因子との結合競合実験を行っていく。これによってリボソームレスキュー因子の使い分けを明らかにしていく。また、選択的リボソームプロファイリング法のためのコンストラクトの作製を行う予定である。
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