2023 Fiscal Year Annual Research Report
a,b-Unsaturated carbonyl sulfation in response to oxidative stress
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21H02119
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
黒木 勝久 宮崎大学, 農学部, 准教授 (20647036)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
服部 秀美 宮崎大学, 農学部, 教授 (80508549)
榊原 陽一 宮崎大学, 農学部, 教授 (90295197)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 硫酸化 / C-スルホン化 / a,b-不飽和カルボニル / NAPQI / 活性阻害 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、「硫酸化を受けるa,b-不飽和カルボニル化合物の硫酸化代謝解析」と「親電子ストレスによるSULTの発現変動解析」、そして、「a,b-不飽和カルボニル化合物によるSULT阻害作用解析」を実施した。
①硫酸化を受ける新たなa,b-不飽和カルボニル化合物の硫酸化代謝解析:肝臓・小腸lysateはカテコールアミン酸化代謝物の酵素活性が確認された。ニコチンアミドを硫酸化する酵素を詳細に解析した結果、2PY(N-Methyl-2-pyridone-5-carboxamide)に対して、SULT1A1とSULT1C4が弱い活性を示した一方、4PYに対しては活性を示さなかった。また、2-cyclopentenoneと2-cyclohexenoneに対するヒトのSULT酵素の活性確認を行った結果、ヒト13種類のヒトSULT酵素の中でもSULT1C4が2-cyclohexenoneに対する強い活性を示した。このSULT1C4による硫酸化代謝物は硫酸基脱離酵素による脱離を受けないことから、SULT1C4は主要なa,b-不飽和カルボニル化合物のC-スルホン化酵素であることが想定された。
②親電子ストレスによるSULTの発現変動解析:NAPQIを親電子ストレスのモデル化合物として、SULTのタンパク質発現を定量質量分析法(MRM法)にて確認した。その結果、多くのSULTの発現が減少していることが明らかになった。
③a,b-不飽和カルボニル化合物によるSULT阻害作用解析:NAPQIはSULT1A1, SULT1E1, SULT1C4の酵素活性を弱く阻害することが明らかになった(IC50:100-500uM)。さらに、2PYと4PYによる阻害活性も確認した結果、2PYがSULT1C4阻害を示した。その結果、a,b-不飽和カルボニル化合物はSULTの基質でもあると同時に弱い阻害作用をもつことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
①硫酸化を受ける新たなa,b-不飽和カルボニル化合物の探索と代謝解析:アドレノクロムおよびニコチンアミドの酸化代謝物(2PY)であるa,b-不飽和カルボニル化合物の硫酸化を触媒する酵素を見出した。SULT1C4は主要なa,b-不飽和カルボニル化合物のC-スルホン化酵素であることが想定された。このC-スルホン反応は、当初、a,b-不飽和カルボニル特異的なマウスSULT7A1だけに起こる反応であると想定されたが、ヒトのSULT酵素でも起こることが想定され、当初の想定とは異なる結果が得られた。この項目はおおむね順調に進んでいると判断した。
②親電子ストレスによるSULTの発現変動解析:昨年度は、過酸化処理によって発現変動するSULTを見出すことが出来た。本年度は、NAPQIを新電子ストレスのモデルに用いたが、過酸化処理とは異なって、発現上昇したSULT酵素は見いだせず、多くのSULT酵素が発現減少した。そのため、更なる発現調節機構の解析を中止し、現在は、NAPQI以外の新電子ストレス物質によるSULT発現への影響を調査している。想定外の結果であったが、本項目もおおむね順調に進んでいると判断した。
③a,b-不飽和カルボニル化合物によるSULT阻害作用解析:NAPQIによるSULT発現減少作用を受け、当初予定にはなかったSULTの活性阻害を検討した。アセトアミノフェンの酸化物であるNAPQIに加え、ニコチンアミドの酸化物であり、腎臓障害が疑われている2PYもSULTの阻害活性は弱く、今後の機能解析には大きな影響はないと判断した。
④マウスを用いたストレス防御機構としての硫酸化の生理機能解析:SULT1C4はマウスにはないため、改めてマウス臓器Lysateによる検討を始めた。よって、本項目はやや遅れていると判断した。
以上の進捗状況・達成度合いを総合すると、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
a,b-不飽和カルボニル化合物の硫酸化を介した酸化ストレス防御機構とその生理的意義の解明を目的とし、本年度は、「a,b-不飽和カルボニル化合物の硫酸化代謝解析と生理的意義」、「親電子ストレスによるSULTの発現変動」、そして、「マウスを用いたストレス防御機構としての硫酸化の生理機能解析」を実施する。
①a,b-不飽和カルボニル化合物の硫酸化代謝解析と機能解析:アドレノクロムおよびカテコールアミン酸化代謝物の硫酸化酵素の同定を行うほか、LC-MSを用いた肝臓細胞における硫酸化代謝解析と硫酸化による細胞毒性の解析を進める。さらに、SULT1C4によるC-スルホン化の発見を受け、NAPQIのほか、過去に硫酸化(スルホン化)を受けることを明らかにしたナフトキノンやメナジオンなどのC-スルホン化の再検討を行う。
②親電子ストレスによるSULTの発現変動解析:a,b-不飽和カルボニル化合物添加による親電子ストレス下での培養細胞におけるSULTの発現解析をmRNAおよびタンパク質レベルで評価する。mRNA発現はデジタルPCRによる絶対定量解析を行い、タンパク質発現は三連四重極型質量分析計を用いた定量質量分析法(MRM: Multiple Reaction Monitoring)にて、15種類のヒトSULTの発現変動を解析する。
③マウスを用いたストレス防御機構としての硫酸化の生理機能解析:マウス臓器Lysateおよびマウス酵素を用いたa,b-不飽和カルボニル化合物の硫酸化確認後、in vivoにおけるアセトアミノフェン酸化代謝物 (NAPQI:N-アセチル-p-ベンゾキノンイミン)の硫酸化の意義を解析するため、NAPQI硫酸化酵素の遺伝子ノックダウン実験を行い、NAPQIの代謝における硫酸化の意義を解析する。
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Research Products
(11 results)
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[Presentation] U937ヒト分化マクロファージの細胞内酸化レベルと貪食能に及ぼすIndoxyl Sulfateの影響とその制御2023
Author(s)
岩本若菜, 池田知弘, 西川大貴, 上田裕人, 平野将司, 小野政輝, 木下英樹, 黒木勝久, 榊原陽一, 水光正仁, 安田伸
Organizer
第59回化学関連支部合同九州大会
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[Presentation] 尿毒素p-Cresyl Sulfateが過酸化水素存在下でHL-60分化ヒトマクロファージ細胞の細胞内酸化レベルに及ぼす影響2023
Author(s)
池田知弘, 岩本若菜, 瀬尾優太, 西川大貴, 上田裕人, 平野将司, 木下英樹, 小野政輝, 黒木勝久, 榊原陽一, 水光正仁, 安田伸
Organizer
第59回化学関連支部合同九州大会
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[Presentation] Tryptophan由来Indoxyl SulfateがU937ヒト分化マクロファージ細胞に及ぼす影響と抗酸化剤による制御2023
Author(s)
岩本若菜, 池田知弘, 西川大貴, 澄川碧緯, 上田裕人, 平野将司, 小野政輝, 木下英樹, 黒木勝久, 榊原陽一, 水光正仁, 安田伸
Organizer
令和5年度(2023年度)日本食品科学工学会西日本支部大会
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