2023 Fiscal Year Annual Research Report
Genetic analysis of species-specific haplotype diversification causing rice reproductive isolation.
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21H02168
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
山形 悦透 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00600446)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 雑種不稔 / ハプロタイプ / 生殖的隔離の打破 / イネ / エピジェネティックス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(研究1) S21-nivおよびS21-mer由来のORF2のゲノムコンストラクトの作成は、当該遺伝子の致死効果により困難であったため、CRISPR-Cas9によるゲノム編集個体の作成に着手した。S21-niv由来、S21-mer由来のORF1を導入した形質転換体を作成し、ホモ接合体を選抜した。S21-merとS21-nivのホモ接合体の一細胞花粉期の花粉を採取し、RNA-seqの準備を行った。ミャンマーの在来品種に関するゲノム解析を行う機会を得たため、ORF2とORF3の多様性に関する解析を副次的に行った。
(研究2) RIPの機能解析: S21-mer由来およびS21-niv由来のORF2プロモーター::ORF2 CDS+GFP融合遺伝子の発現局在コンストラクトの作成に難航している。ORF2/RIPの機能解析については、S21-nivのcDNAクローンは維持できるが、S21-mer cDNAクローンが致死性であり、S21-mer cDNA発現コンストラクトでの発現実験ができない状態である。S21-nivクローンについては機能解析を継続したい。
(研究3) S21-mer/ S21-nivヘテロ接合体の花粉稔性を変化させる遺伝的要因の解明: S21ヘテロ接合体には後代に伝達する可能なエピアレルが存在し、花粉不稔を示すEpiS系統と、稔性回復を示すEpiF系統を確立した。正逆交雑により、S21-nivあるいはS21-merはインプリント遺伝子であり、現時点ではS21-merアレルが経由する配偶子の性により、後代に伝達するエピアレルが変化すると推察した。不稔分げつと稔性回復分げつに由来する止め葉由来のゲノムDNAを用いてバイサルファイトシーケンスによるDNAメチル化領域を推定したが、ORF1およびORF2ともにDNAメチル化の顕著な違いは見られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
S21-niv由来のORF2とS21-mer由来のORF2のゲノミックコンストラクトの作成に取り組んできたが、研究2において、S21-mer cDNAクローンが致死性であることが判明したため、ORF2の遺伝子導入については中断した。研究3において、S21/mer/S21-nivの交雑組合せにおいては、S21-merあるいはS21-nivがインプリント遺伝子として働くことから、DNAメチル化、特にRNA依存的DNAメチレーション(DdRM)によるサイレンシングと推察した。ORF2単体の遺伝子機能というよりはむしろ当該ゲノム領域のDNAメチル化状態が重要であるため、当該ゲノム領域に直接変異を導入できるCRISPR/Cas9が適切であったと考えられた。早期にゲノム編集個体を作成し、研究を進展させたい。
雑種不稔のインプリント遺伝子はこれまで報告がない。また、現段階では検証中であるが、S21-mer/S21-niv間のパラミューテーションの可能性も示唆される結果が得られている。これらの諸現象の基盤となるのはRdDM経路と推察されるので、当初の計画とは異なるが、エピジェネティック現象の原因となるDNAメチル化領域の同定とその挙動にフォーカスを当てて研究をまとめていくことを検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
(研究1) すでに作成したCRISPR-Cas9の形質転換コンストラクトをS21-mer NILおよびS21-mer NILに導入し、変異体を作成後、両者を交雑し、当該遺伝子の必要性を明らかにする。同時にエピジェネティック諸現象がどのように変化するかも考察する。特にS21-nivにはタンデム重複によるトランスポゾンの増加がみられるため、当該領域がRdDM経路によりサプレッションされている可能性があるため、タンデム重複を喪失させたゲノム編集個体についても作出する。
(研究2) S21-mer/S21-niv交雑組合せにおいては、エピジェネティック制御により、遺伝子型通りの表現型を示すことが保証されていなかったが、昨年度、安定して稔性回復を示すEpiF系統とキメリックに不稔と稔性回復分げつを示すEpiS系統を確立した。この実験材料を用いてRNA-seq解析を行う。エピアレル間で候補遺伝子であるORF1やORF2の発現状態が異なることを期待している。プログラム細胞死の実験についても、エピアレルの遺伝が明確になったことで実施可能となったため、これを行う。
(研究3) 昨年度確立したEpiF系統とEpiS系統より、葯より抽出したゲノムDNAについてバイサルファイトシーケンスを行う。特に、S21-nivアレルが保有するタンデム重複領域に着目し、RNA-seqの解析と総合的に考察する。パラミューテーションの可能性を検討するため、S21-mer NILとS21-niv NILと雑種F1におけるメチレーション変化を解析する。RdDMとの関連を検討するためRDR2変異体を九大のイネリソースセンターよりスクリーニングし、交雑を行う。
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Research Products
(1 results)
