2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of precise genome editing technology without genetic transformation or tissue culture in conifer species.
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21H02242
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Forest Research and Management Organization |
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Principal Investigator |
七里 吉彦 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (80461292)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩崎 崇 鳥取大学, 農学部, 准教授 (30585584)
遠藤 圭太 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 林木育種センター, 主任研究員 等 (00754368)
小長谷 賢一 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (30582762)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / スギ / 直接導入 / 樹木 / in planta |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでに新規膜透過性ペプチドである「ポリヒスチジン」を用いて、スギ培養細胞へゲノム編集タンパク質を一過的に導入し、狙った領域のDNA配列を改変することに成功している。この直接導入法を茎頂分裂組織に適用することで、遺伝子組換え・組織培養を介さずにゲノム編集個体を得る、「in planta直接ゲノム編集法」を確立することが本課題の目的である。本年度は（1）茎頂分裂組織へのタンパク質導入条件の検討、（2）改良型Cas9タンパク質合成系の構築、（3）標的遺伝子の単離、について実施した。
（1）について、材料としてスギ培養細胞から分化される「不定胚」を用いた。不定胚に水溶液を浸透させる条件検討を行った結果、培養期間を3日間に延長することで水溶液が不定胚全体に浸透することが明らかとなった。
（2）について、脱アミノ酵素を利用して標的とする塩基CをTに置換するTarget-AIDタンパク質の大腸菌での合成を試みた。合成したタンパク質は期待通り標的領域の塩基置換に寄与することがin vitro試験により明らかとなった。ただ、このタンパク質溶液中に混在するエンドトキシンにより細胞の成育に悪影響を与えていることが示唆された。そこで、大腸菌の株を変更し、タンパク質溶液中のエンドトキシン量を従来の1/1000に抑えることに成功した。現在この株を用いて試験で使用するゲノム編集タンパク質を合成している。
（3）について、カラマツから標的遺伝子を探索し、葉緑体合成に関与するマグネシウムキラターゼ（ChlI）遺伝子と点変異により除草剤耐性が付与されるアセト乳酸合成遺伝子（ALS）を単離した。ゲノムデータベースの情報より、カラマツにおいてChlIは複数コピー、ALSは1コピー存在することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に計画した各小課題について、それぞれが計画どおりに進展していることから、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は（1）茎頂分裂組織へのゲノム編集タンパク質導入条件の検討、（2）ゲノム編集効率を向上させる物理的・化学的処理の検討、（3）スギやカラマツのマイクロプロパゲーション方法の確立、（4）カラマツにおける組織培養系の構築、を計画している。
（1）について、昨年度に不定胚にて確立した条件に加えて減圧処理などの物理的処理を併用し、不定胚などにゲノム編集タンパク質を導入し、分化してきた芽のゲノム編集効率を調査する。
（2）について、これまでスギ培養細胞を用いた試験ではゲノム編集タンパク質溶液を導入することができていたが、茎頂分裂組織のゲノム編集には深い細胞層にまでゲノム編集タンパク質を到達させる必要がある。そこで、物理的・化学的処理の適用を試みる。具体的には減圧処理、マイクロニードルなどを用いた茎頂の致傷処理などを計画している。
（3）について、in planta直接ゲノム編集法の確立の際に問題となっているのが、実験に用いる若い茎頂を大量に得られないという点である。この問題を解決するため、組織培養技術により、スギ及びカラマツの茎頂を培養ビンにて大量に増殖する方法を確立する。具体的には固形培地に添加する植物ホルモンの最適化などを検討する。
（4）について、カラマツにおいてもスギと同様に培養細胞から不定胚を分化させ、直接導入法に供することを目的に、カラマツ未熟胚を初発とする培養細胞系を確立する。
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