2023 Fiscal Year Annual Research Report
Development of precise genome editing technology without genetic transformation or tissue culture in conifer species.
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21H02242
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Forest Research and Management Organization |
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Principal Investigator |
七里 吉彦 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (80461292)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩崎 崇 鳥取大学, 農学部, 准教授 (30585584)
遠藤 圭太 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 林木育種センター, 主任研究員 等 (00754368)
小長谷 賢一 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (30582762)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / スギ / 直接導入 / 樹木 / in planta |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題の遂行のため、本年度は（1）茎頂分裂組織へのゲノム編集タンパク質導入条件の最適化、（2）ゲノム編集効率を向上させる界面活性剤の使用条件の最適化、そして直接導入系のブラッシュアップのためのGFP復活系の構築を行った。さらに、（3）カラマツ培養細胞におけるゲノム編集条件の検討について実施した。
(1)、(2) 茎頂組織へのタンパク質導入効率を向上させる目的で、スギ芽生えの乾燥処理を試みた。以前スギ不定胚で試みた際は、24時間の乾燥処理で色水吸収性が大幅にアップしたが、芽生えでは組織から水分が速やかに失われてしまい、生存率が大幅に減少する結果となった。また、RNPバッファーに界面活性剤とCo, Cu, Ni等の金属イオンを添加することで、取り込み効率が1.5倍程度向上した。
[GFP復活系の構築]
細胞でのゲノム編集効率を算出するために、次世代シーケンサーによる網羅的な塩基解析が用いられている。しかし、この方法はDNA抽出という破壊的な工程を伴うため、経時的な経過観察が不可能である。そこで、非破壊的かつ経時的なゲノム編集効率の見積もりのため、変異を加えた緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子（以下GFPm）をあらかじめスギに導入し、ゲノム編集によりこれを改変することでGFP蛍光が回復する、という「GFP復活系」を構築した。この系がスギ細胞で機能するか検証するため、GFPm導入スギ細胞系統を作出し、それらにGFP蛍光回復のためのゲノム編集ベクターを導入した。その結果、期待通り細胞でのGFP蛍光の回復が見られた。
(3)カラマツにおいてマグネシウムキラターゼ遺伝子を単離し、標的領域を2つ選定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に計画した各小課題について、それぞれが計画どおりに進展していることから、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度に、変異を加えた緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子(以下、GFPm)をあらかじめスギ細胞に導入し、ゲノム編集によりこれを改変することでGFP蛍光が回復する、という「GFP復活系」を構築した。これにより、非破壊的かつ経時的にゲノム編集効率を見積もることが可能となった。今年度はこのGFP復活系を用いて、以下の研究計画を行う予定である。
【1. 茎頂分裂組織へのゲノム編集タンパク質導入条件の最適化】 GFPmを導入したスギ細胞から不定胚を誘導し、不定胚の茎頂を標的にGFP蛍光を復活させるゲノム編集をCPP直接導入で試みる。
【2. GFF復活系を用いたゲノム編集効率を向上させる界面活性剤の迅速スクリーニング】 これまでもスギの細胞を用いた直接導入試験において、ゲノム編集効率を向上させる界面活性剤の探索を行ってきたが、実験の再現性や結果が出るまでの煩雑さから、まだ決定版の界面活性剤は見いだせていない。今回GFP復活系を用いて、迅速にゲノム編集効率を向上させる界面活性剤を選定する。
【3. 薬剤耐性タンパク質とゲノム編集タンパク質の共導入系の構築】 直接導入された細胞の選抜を試みるため、ゲノム編集タンパク質と同時に薬剤耐性タンパク質、具体的にはスギの遺伝子組換え細胞の選抜に用いられているNPTIIタンパク質を用いて、抗生物質耐性を一時的に付与された細胞が単離できるか条件検討を行う。
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