2023 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular studies on sex differentiation, oocyte maturation, ovulation, and egg quality loss in sturgeons
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21H02264
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
足立 伸次 北海道大学, 水産科学研究院, 名誉教授 (40231930)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (90425421)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | チョウザメ / 性分化 / 卵成熟 / 排卵 / 卵質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）性分化：昨年度は、雌特異的ゲノム領域上に存在する遺伝子のうち、未分化生殖腺で発現する遺伝子Xを特定し、本遺伝子内配列および雄特異的プライマーを用いることで、調べたすべてのチョウザメ種で偽雄や超雌を識別した。本年度は、遺伝子Xおよび性分化関連遺伝子の発現変化を調べ、性的二型発現を示す遺伝子を複数明らかにすることができた。これら遺伝子の生体外培養による発現制御解析を試みたが、稚魚の生残が悪く、十分な未分化生殖腺を採取できなかった。しかし、培養に用いる組換え生殖腺体細胞由来増殖因子(Gsdf)を作製するための2種のgsdfの全長ORFを単離できた。
２）卵成熟・排卵：チョウザメの場合、生体外培養で卵成熟能および排卵能を確認した後、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）注射で卵を得ているが、タイミングが不適切な場合は良質卵は得られない。しかし、排卵能確認には数日要する。排卵能獲得前後に発現消長する排卵誘導マーカーを指標とした推定法を確立できれば、短時間で採卵適期の推定可能となる。本年度は、アムールチョウザメの排卵誘導マーカーsfrp2（Wntインヒビター）について発現動態を調べた結果、GnRH注射前では高発現であったが、GnRH注射によりほぼ消失した。
３）卵質悪化：これまで、ニホンウナギにおいて、母性mRNA量および局在の差異から、孵化までの胚発生異常が生じる不良卵の分子生物学的特徴の一部を明らかにしている。本年度は、これまで得てきたアムールチョウザメ卵の中で、比較的卵質が良いと思われるサンプルをNGSに供し、ESTdbを構築した。また、in situ hybridizationにより、卵母細胞の発達に伴うsybu（母性mRNAのひとつ）の発現局在を調べた。その結果、周辺仁期から油球形成後期において、油球形成の進行に伴い細胞質全体から周縁部に局在が変化することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）性分化：本年度は、遺伝子Xおよび性分化関連遺伝子の生体外培養による発現解析のためのgsdf2種の全長ORFを単離した。既に組み換え濾胞刺激ホルモン(FSH)は作製済であるため、より詳細な生体外培養実験環境を整えることができた。また、純粋種アムール（ZW）と雑種カラマム（カルーガ1/4、アムール3/4）の偽雄（ZW）と交配させ、雑種アムカラマム（アムール7/8、カルーガ1/8）の作出に成功した。これらアムカラマムの中に超雌（WW）の存在を確認したが、昨年度開発した超雌検出用プライマーではZWとWWを区別できなかった。
２）卵成熟および排卵：本年度は、アムールチョウザメの排卵誘導マーカーsfrp2について、生体外培養実験したところ、組換えLH添加によりmRNA発現が低下した。また、sfrp2が劇的に発現低下したことからGnRH注射によりWntシグナルが活性化すると考え、排卵能獲得に関与するptgs2の転写調節にWntシグナルが関与するか調べた。その結果、Wntアゴニスト添加培養により、卵濾胞におけるptgs2発現は増加した。さらに、レポーターアッセイでも、Wntアゴニストによりプロモーター活性が上昇し、排卵期のptgs2の転写活性化にはWntシグナルが関与することを明らかにした。以上のように、卵濾胞の排卵能獲得機構研究はさらに進展した。
３）卵質悪化：卵母細胞の発達に伴うsybuの発現局在を調べた結果、油球形成に伴い細胞質全体から周縁部に局在が変化することを明らかにしたが、卵黄形成初期から卵黄形成後期の卵母細胞および卵では、陽性シグナルは認められなかった。チョウザメの母性mRNA局在解析は長年行なっているが、他魚種と比べると非常に難しい。mRNA量と卵質との相関に関しては、多くは無関係であるが、中には相関がみられるものがあるので、強く相関するものを探索した方がよいかもしれない。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）性分化：今後は、未分化生殖腺をFSHやGsdfなど各種ホルモンとともに培養し、発現誘導される遺伝子を調べる。また、これまで使用してきた ZWとWWを判別可能なプライマーでは、一部の雑種チョウザメで判別結果が不安定になった。定量PCRではZWとWWを識別可能なことから、今後は、定量PCRと併せて検討することで、さらに性判別プライマーを改善する。全雌生産技術開発については、雑種ベステルの超雌（WW）を雄化処理してあるため、これら個体が精巣を有するかを確認する。また、他のチョウザメ種の超雌も作出する。 ２）卵成熟および排卵：昨年度は、排卵誘導マーカーを発見し、生体内外で発現動態を調べた。授精可能になった卵は卵濾胞組織の一部（卵巣薄板上皮との接着部位）の裂孔から排卵されるため、その裂孔部位には特異的遺伝子発現がみられるはずである。今後は、in situ hybridizationによりマーカー遺伝子の発現部位を特定する。また、その結果を受けて、いくつかの遺伝子産物の特異抗体を作製する。
３）卵質悪化：昨年度は、in situ hybridizationにより、周辺仁期から油球形成後期の卵母細胞におけるsybuの発現局在を明らかにした。今後は、GnRH注射直前の卵母細胞や卵においても、発現局在を明らかにし、卵質との関係を評価する。チョウザメでは、排卵後の過熟化は比較的遅く、半日程度では孵化率の低下はない。従って、卵質は排卵前の卵母細胞ステージとGnRH注射のタイミングでほぼ決定すると考えられる。２）のように、排卵誘導マーカーを得ているため、今後は、これらマーカー遺伝子の発現と卵質との関係を明らかにする。
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