2022 Fiscal Year Annual Research Report
自然宿主モデルを用いた細菌感染の感受性と特異性に関与する因子の探索
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21H02360
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
度会 雅久 山口大学, 共同獣医学部, 教授 (40312441)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 細胞内寄生菌 / 自然宿主 / 共生 / マクロファージ / ゾウリムシ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内寄生菌は増殖するステージと共生(休眠)するステージがあることが知られている。宿主内における増殖と共生の双方に関与する因子の同定は、宿主の感受性の差異を解明する手がかりとなる。本研究では自然宿主感染モデルを用いて、共生と感染の間で機能する新規因子群を探索する。細胞内寄生菌の代表として野兎病菌およびノビシダ菌、レジオネラを用い、終宿主感染モデルとしてのマクロファージと自然宿主モデルとして原生生物のゾウリムシを用いて検討を行なった。
ゾウリムシはレジオネラや野兔病菌の自然宿主になり得る。しかし、全てのゾウリムシが自然宿主として機能するのではなく、その適合性は種や株に依存することが報告されている。ゾウリムシは接合型やシンジェンなどの差異によって多くの種や株が存在するが、形態学的にこれを分別することは困難である。そこで、random amplified polymorphic DNA (RAPD)法を応用した遺伝学的手法により、ゾウリムシを簡便に分類・同定する手法の構築を試みた。その結果、RAPD法の結果を元に構築したmultiplex PCRを併用することで、複数の株を特異的に識別することが可能となった。今後は病原細菌の自然宿主となり得るゾウリムシ株を同定・検出する技術に発展させていく予定である。
野兎病菌は宿主免疫を抑制することが知られているが、そのメカニズムは不明である。宿主免疫抑制に関与する菌側因子を同定するために、ノビシダ菌を用いて、トランスポゾンによるランダム挿入変異体ライブラリーを作成し、U937細胞感染時における免疫抑制効果に与える影響を解析した。その結果、免疫抑制因子としてノビシダ菌のジヒドロオロターゼをコードするpyrC遺伝子の欠損株は宿主免疫抑制機能が低下することが示された。詳細な機能解析により、宿主免疫抑制機構の一端を明らかにすることができると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新たな原生生物モデルとしてゾウリムシ(Paramecium caudatum)の有用性に着目し、細胞内寄生菌の自然宿主モデルの解析を行っている。本年度は分子生物学的手法を用いたゾウリムシの分類、型別法を構築し、菌の寄生・共生との関連を解析するための基盤整備を行った。また、トランスポゾンを用いたランダム挿入変異法により、宿主免疫抑制機能が阻害された変異株の作出を行い、原因遺伝子の同定とその機能解析を実施した。その結果、ノビシダ菌の感染時に認められる宿主の免疫抑制作用に本研究で見出されたPyrCが関与することが示唆された。今後これらの菌株の性状解析をさらに進めるとともに自然宿主モデル内増殖について検討を行う。宿主への共生に関与する因子(共生因子)の機能解明がさらに進むものと期待される。概ね計画どおり進捗していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
概ね計画どおり進捗しているため、計画どおり研究を進める。細胞内寄生菌であり、動物を含めた環境中に広く分布する病原細菌の代表としてレジオネラおよび野兎病菌、自然宿主モデルとしてゾウリムシおよびカイコを用いて解析する。ゾウリムシおよびカイコとカイコ由来細胞株内に共生できない変異株を作製し、共生関連因子を分離・同定する。その因子の機能、特に宿主の細胞内輸送や免疫調節機能に注目して遺伝学的および分子生物学的手法を用いて解析する。細胞内増殖に関与する既知の病原因子である、IV型およびVI型分泌機構とそのエフェクター因子の発現と機能について自然宿主モデルを用いて解析し、その役割を検討する。さらに新規菌側および宿主側因子の同定と機能解析を行い、共生機構に関与する因子が感染制御に応用可能かどうか明らかにする。具体的には以下の項目を行う。
変異株作製による共生に関与する因子の探索:自然宿主への共生に必要な菌側因子を検索するために、トランスポゾンを用いたランダム挿入変異法により、共生しない変異株の作出を行う。これまでに分離した変異株について、機能解析を行うことにより、病原因子の新たな機能を提示できるものと考えられる。
ゲノム情報を用いた比較解析：自然宿主モデルのゾウリムシやカイコに共生する細菌が知られており、ゲノムの解析が進んでいる。これらの情報をもとにレジオネラ、野兎病菌のゲノムと比較解析し、共生に関連すると予測される因子を選定する。予測された因子の変異株を作製し、感染への影響を解析する。宿主側のゾウリムシのゲノム解析も進めており、宿主側因子の解析も並行して行う。
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