2022 Fiscal Year Annual Research Report
Development of treatment and animal model for SFTS based on genome-wide screening.
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21H02361
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
岡林 環樹 宮崎大学, 農学部, 教授 (10359995)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 裕輔 大阪大学, 微生物病研究所, 特任教授(常勤) (00294124)
齊藤 暁 宮崎大学, 農学部, 准教授 (30621792)
山田 健太郎 宮崎大学, 農学部, 准教授 (70458280)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | ゲノムワイドスクリーニング / 重症熱性血小板減少症候群 / マウスモデル / 受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重症熱性血小板減少症候群（SFTS）の致死率は15-20%にも及ぶが、現在までに特異的治療法は確立されていない。その理由として適切な小動物モデルがないことが挙げられる。そこで本研究では、ゲノムワイドスクリーニング法により、SFTSV増殖を制御する宿主因子を同定し、特異的治療法の開発につなげていく。また組換ウイルスを用いた超高感度in vivoイメージング解析により、正常な免疫能を持つ小動物モデルでの病態解明、治療効果を検証する。
課題1： ゲノムワイドスクリーニングによる新規SFTSV増殖制御宿主因子の同定:CRISPR/Cas9ノックアウトライブラリーを用いてSFTSウイルス感染時の細胞変性効果（CPE）を指標にしたスクリーニングと、２）CRISPR-activationライブラリーを用いて蛍光タンパク質を発現できるSFTSシュードウイルスの易感染性を指標にしたスクリーニング、によってSFTSウイルス増殖に必須な宿主因子の網羅的同定を開始し、ウイルスの新規レセプター候補遺伝子Xを同定した。X因子の過剰発現によるSFTSVの感染増強を確認した。抗Gn抗体では感染が抑制されず、Gcタンパク質の膜融合を抑制するペプチド添加により感染が抑制することから、Gc依存的に侵入する際に関連する機能因子であることを確認した。
課題2：新規小動物モデルとレポーター発現ウイルスを用いた病原性発現機構の解析：
M分節ゲノムプラスミド、L分節ゲノムプラスミドに加えて、レポーター遺伝子（BDFP1.8、NanoLuc、もしくはsecNanoLuc）をNS遺伝子の上流に2A配列で連結して配置した組換えS分節ゲノムプラスミドをそれぞれ構築し、大臣確認を得た。各ゲノムプラスミドを細胞に共導入して組換えウイルスの増殖性を蛍光により確認した。しかしながら、その増殖性が確認できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
課題1：研究進行に遅れが出たが、新規レセプター候補遺伝子Xの同定、その機能解析までは実施することができた。
課題２：ゲノムプラスミドを共導入した293T細胞におけるBDFP1.8発限とウイルス蛋白質発現を重ねると、両者の局在が一致しなかったことから、ゲノム鎖RNAの複製とそれを鋳型にしたウイルスmRNAの転写が起こっていない可能性が考えられた。そのため感染性粒子の形成に至らなかったと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題1：候補遺伝子Xについて、CRISPR/Cas9を用いてノックアウト細胞を作製する。作製した細胞にSFTSVを感染させ、ウイルス増殖性を評価する。このようにしてSFTSV増殖制御宿主因子Xの機能を解析する。また、因子Xに対する特異的阻害薬について抗SFTSV活性を評価する。さらに因子Xに着目したSFTSV宿主域決定機構の解明に取り組む。
ネコ（高感受性）、ヒト（中感受性）、マウス（低感受性）由来細胞における比較ウイルス学的研究を展開する。具体的には、因子Xのホモログについて、上記因子X欠損ヒト細胞で一過性に発現させ、SFTSV増殖をどの程度サポートするかを検討し、SFTSV宿主域決定にどのように関与しているかを明らかにする。動物種によってSFTSV増殖サポート能力に違いを見出した場合、これらのキメラタンパク質を作製し、どのドメインが宿主域決定に重要であるかを解明する。
課題2: 他の報告と同様のシステム、すなわちプラスミドからのゲノムRNAの供給について、今回のpol-IIにより駆動してcap構造を含めた余計な配列をハンマーヘッド型リボザイムで取り除く方法ではなく、余計な配列等が付加されないT7polもしくはpol-Iのみで行い、NPとRdRpの供給をヘルパープラスミドで供給する方法を検討する。また、SFTSVの受容体の一つと言われるDC-SIGNを過剰発現したVero細胞やHuh-7細胞を用いることで少量の感染性ウイルス粒子をより効果的に増殖させるようにする。
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