2023 Fiscal Year Annual Research Report
Development of treatment and animal model for SFTS based on genome-wide screening.
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21H02361
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
岡林 環樹 宮崎大学, 産業動物防疫リサーチセンター, 教授 (10359995)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齊藤 暁 宮崎大学, 農学部, 准教授 (30621792)
山田 健太郎 宮崎大学, 農学部, 教授 (70458280)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 重症熱性血小板減少症候群 / ゲノムワイドスクリーニング / マウスモデル / in vivoイメージング / 宿主因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重症熱性血小板減少症候群（SFTS）の致死率は15-20%にも及ぶが、現在までに特異的治療法は確立されていない。その理由として適切な小動物モデルがないことが挙げられる。そこで本研究では、ゲノムワイドスクリーニング法により、SFTSV増殖を制御する宿主因子を同定し、特異的治療法の開発につなげていく。また組換ウイルスを用いた超高感度in vivoイメージング解析により、正常な免疫能を持つ小動物モデルでの病態解明、治療効果を検証する。
課題1： ゲノムワイドスクリーニングによる新規SFTSV増殖制御宿主因子の同定:CRISPR/Cas9ノックアウトライブラリーを用いてSFTSウイルス感染時の細胞変性効果（CPE）を指標にしたスクリーニングと、２）CRISPR-activationライブラリーを用いて蛍光タンパク質を発現できるSFTSシュードウイルスの易感染性を指標にしたスクリーニング、によってSFTSウイルス増殖に必須な宿主因子の網羅的同定を行った。それによりチロシンキナーゼ受容体である「AXL受容体」を同定した。またヒトDC-SIGN発現Vero細胞におけるSFTSウイルスの増殖性及びCPE誘導性を確認している。
課題2：新規小動物モデルとレポーター発現ウイルスを用いた病原性発現機構の解析：
我々がマダニから分離したウイルス株で、既報（Brennan et al, J. Virol, 2015）を 参考にして組換えウイルス作製系を構築した。さらに、回収したレポーター発現SFTSウイルスの特徴（感染性、増殖性、レポーター遺伝子発現性）を検証し、イメージング解析に最適な組換えウイルスを選別した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゲノムワイドスクリーニング（網羅的遺伝子ノックアウト）により、 SFTSウイルス増殖制御宿主因子の同定に取り組み、チロシンキナーゼ受容体である「AXL受容体」を同定しすることに成功した。またヒトDC-SIGN発現Vero細胞におけるSFTSウイルスの増殖性及びCPE誘導性を確認することができた。
我々がマダニから分離したウイルス株で、既報（Brennan et al, J. Virol, 2015）を 参考にして組換えウイルス作製系を構築した。回収したレポーター発現SFTSウイルスの特徴（感染性、増殖性、レポーター遺伝子発現性）を検証し、イメージング解析に最適な組換えウイルスを選別し、細胞内における増殖性を確認することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ウイルス感染性評価や病態解析を容易にするために作成したレポーター発現ウイルスの特徴（感染性、増殖性、レポーター遺伝子発現性）を検証し、in vivoイメージング解析に最適な組換えウイルスを選別する。今年度はレポーター発現SFTSウイルスを用いて、マウスにおけるイメージングへの応用を実践する。治療抗体候補となる各種中和抗体や化合物のスクリーニングを培養細胞レベルとマウスレベルで実施する。
ゲノムワイドスクリーニング（網羅的遺伝子ノックアウト）により同定した「AXL受容体」のSFTSウイルスの増殖性及びCPE誘導性への影響をさらに明らかにしていく。今年度は、AXLとDC-SIGNの作用機序の解明のために、SFTSV宿主域決定をするために、各種動物細胞（ヒト、ネコ、イヌ、ウシ、マウスほか）におけるAXLとDC-SIGNの特徴を発現量、その遺伝子配列情報と、SFTSウイルス感染性との関連性を比較し、動物種によるSFTS感染性とウイルス受容体候補因子との関連性を明らかにする。また、各種動物に由来するDC-SIGNやAXLの過剰発現細胞、siRNAやCRISPR/Cas9によるノックアウト細胞を作製する。ノックアウト細胞においてウイルス増殖のどのステップがブロックされているのかを分子ウイルス学的に解明していく。具体的には、ノックアウト細胞において、野生型、欠損型、点変異を持つDC-SIGNやAXLを一過性に発現させ、SFTSV増殖においてDC-SIGNやAXLのどのドメイン活性が重要なのかを解明する。また、DC-SIGNやAXLに対する特異的阻害薬について抗SFTSV活性を評価する。またDC-SIGNやAXLについては、受託サービスを利用してそれを導入/欠 失した遺伝子組換えマウスを作製する。
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