2022 Fiscal Year Annual Research Report
Residue-specific Linear Free Energy Relationship is the physicochemical basis of protein folding
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21H02448
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 立体構造 / NMR / 自由エネルギー直線関係 / コンシステンシー原理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛋白質分子の2状態交換過程をアミノ酸残基ごとに解析すると，残基間で平衡定数Kや交換速度kの値に分布があり，log k vs log Kプロットを作ると直線関係があることを発見した．過去の論文をサーチして，残基毎の平衡定数と速度定数の報告を集めることで，残基レベルの自由エネルギー直線関係が普遍的であることを示した．この性質は蛋白質分子が変性状態から天然状態へ巻き戻りをスムーズに起こすための物理化学的基盤として提案された「コンシステンシー原理」の実験的な反映であると想定して研究を進めている．
NMR測定における測定バイアスを完全に除去する方法として，HSQC0実験とΠ解析法を組み合わせが有効である．R4年度はこれをα-スペクトリンのSH3ドメイン（62残基）の2状態交換に適用した．しかしながら，明確な残基レベルの自由エネルギー直線関係が見出せなかった．これはスペクトリンSH3の変性状態と天然状態の交換が例外的に非常に遅いこと(0.1 s-1)を反映して，NMRスペクトルとしては2状態に見えるが，変性状態あるいは遷移状態に第３の状態（構造）が存在するなどの原因が考えられ，次年度も検討を続ける．
コンシステンシー原理との関係を理論的に考察した．コンシステンシー原理から，log k vs log Kプロットにおける2点間の傾きと当該2残基のそれぞれのφ値（遷移状態におけるN状態の割合）の間の関係式を導き，これを満たすlog k vs log Kプロットの関係が2次関数であることを証明した．したがって，直線関係は実は2次関数の近似である．R4年度に論文投稿し，現在改訂中である．審査員の批判的な意見に応えるべく，全体の導出過程を大幅に刷新することで，残基レベルの自由エネルギー直線関係の意義がさらに明確になった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NMR測定は長時間を要するために，一つの試料について一連の測定を開始する前に，注意深い事前の予備的検討を行っている．具体的には試料の安定性のチェック，溶液のｐHや測定温度の最適化などである．理論的研究においても，過去に多くの蛋白質について膨大な研究例が存在するので，網羅的に文献情報を集めて考察を行っている．最終結果を急ぐ事なく，着実に研究を進める．
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| Strategy for Future Research Activity |
蛋白質の変性状態からの巻き戻り反応は非常に速く，高度に偏った平衡であり，NMR法を適用することが困難である．そこで，特別な蛍光特性を持つ非天然アミノ酸を位置特異的に導入した蛋白質分子を調製し，スットプトフロー蛍光測定を行うことを新たに計画している．申請時には第二の課題として人工蛋白質設計や薬剤設計に活用できるとしたが，未だ本研究が基礎段階にあるので，検討は今後の課題である．
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