変異型アクチンの試験管内バイオジェネシスとその分子機構の解析

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H02468
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 町田 幸大 兵庫県立大学, 工学研究科, 准教授 (20553093)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野井 健太郎 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 特任助教 (30588405)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: ヒトアクチン / バイオジェネシス / 試験管内 / 再構成

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、申請者が開発したヒト因子由来の再構成型タンパク質合成系を利用して、アクチンのN末端修飾がアクチンの重合反応（線維化）に与える影響を解析するための実験系の構築を行った。これまでの再構成型タンパク質合成系で利用していたC型肝炎ウイルス（HCV）由来のinternal ribosome entry site（IRES）を持つ発現ベクターでは、HCV IRES由来のアミノ酸配列（MSTNPKPQRKTGS）が目的タンパク質のN末端に付加されるため、N末端修飾の詳細な解析を行うことが出来なかった。そのため本実験では、HCV IRESをクリケット麻痺ウイルス（CrPV）由来のIRESに変更することで、アクチンのN末端を任意の配列から合成できるようにした。CrPV IRESではAlaが第一アミノ酸になると報告されており、このAlaにあたる塩基を、アクチンの第一アミノ酸にできるようにベクターを構築した。現在、上記の変更を施したヒト因子由来の再構成型タンパク質合成系で、アクチンのN末端をMDDD、RDDD、DDDの様に変化させたものを合成し、共焦点顕微鏡解析とHS-AFMによる重合の変化の様子と、質量分析によるN末端配列の解析を行っている。ヒト因子由来の再構成型のタンパク質合成系を利用した上記の実験は、in vitroで各種のアミノ酸修飾の意義を正確に解析するための基盤技術になると期待される。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

質量分析の前段階において、市販されており使用実績があるとされるアクチンのN末端アミノ酸の1残基の違いを認識する抗体を用いて、ヒト因子由来の再構成型タンパク質合成系で合成した、各種アクチン群を解析しているが、N末端の配列が予期した配列と異なる結果が得られているため。また、分担者の所属に移動がありHS-AFMの解析が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、ヒト因子由来の再構成型タンパク質合成系によるアクチンバイオジェネシスとHS-AFMによる線維化のリアルタイム解析の融合について、研究分担者と連携しながら研究を進めて行く。また、アクチンのN末端修飾が重合反応に与える影響についても調査を進めてきたうえで、市販されており使用実績があるとされるアクチンのN末端アミノ酸の1残基の違いを認識する抗体を用いて、ヒト因子由来の再構成型タンパク質合成系で合成した、各種アクチン群を解析しているが、N末端の配列が予期した配列と異なる結果が得られているため、質量分析も合わせて解析を進めて行く。