2021 Fiscal Year Annual Research Report
天然変性領域 (IDR) 形成を支えるスプライシング機構から俯瞰する相分離現象
| Project/Area Number |
21H02476
|
|---|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
増田 章男 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (10343203)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石垣 診祐 滋賀医科大学, 神経難病研究センター, 教授 (40378170)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | 天然変性領域 / 相分離 / RNA結合タンパク / スプライシング |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
IDR（天然変性領域）とRNA結合蛋白（RBP）の関係性を明らかにするため、生化学実験とBioinformatics解析の両面から探索を進めた。
生化学実験で、人工天然変性領域の配列スクリーニング評価を行っていたところ、予期せぬことに、天然変性領域の相当割合が細胞内顆粒を形成せず、代わりに微細な網目状ネットワークを形成することが判明した。これまでのところ、天然変性領域を持つタンパクが細胞内で網目構造を持つことは、例外的な報告にとどまっており、その生理的意義は現在のところ全く解明されていない。その科学的重要性を考慮し、まず網目状ネットワークを精細に観察できる超解像度顕微鏡実験系の構築を行った。網目構造は、径100-400nmほどのポアサイズであり、超解像度顕微鏡の分解能限界に近い。このため、サンプルの固定法から染色・検出法に至るまで様々な条件検討を行い、十分な網目構造検出能を持つ解析系の構築に成功した。
また、Bioinformatics解析で、annotation databaseから得られたヒト蛋白の全配列情報をもとに、IDRをコードするエクソンの分類を進めた。アミノ酸の組成/電荷/疎水性をもとに分類を行い、6種類のクラスターへの分別に成功し、RBPが特に集積しているクラスターを2つ発見した。
これら2つのクラスターに属するRBPから数個ずつRBPを選択し、それらのリコンビナント蛋白を作製し、生化学的性質の違いを明らかにした。
さらに、RT-PCRやtRIP解析、共免疫沈降実験などの生化学実験により、細胞内でのこれらクラスターRBP群の相互作用の検証を行い、スプライシングをはじめとするRNA代謝における生理的意義を検討した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初、天然変性領域の蛋白が細胞内顆粒を形成する、との見込みで研究を行っていた。しかし想定に反し、人工天然変性領域の配列の相当割合が細胞内顆粒を形成せず、代わりに微細な網目状ネットワークを形成することが判明した。
このため、網目状ネットワークを精細に観察できる実験系の新たな構築が必要となり、その実現に時間を割いたため、当初の計画よりも進捗が遅れ気味となった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
網目状ネットワークを精細に観察できる超高解像度顕微鏡実験系の構築ができたため、今後、その定量解析方法の高精度化を検討する。各種RNA結合タンパクの抗体染色による核内RBP分布検出を様々なパラメーターを用いて解析できる統合的in silico画像定量ツールの構築を目指す。
また、細胞・生化学実験を用いた正常RBPの細胞内機能解析をさらに進め、患者変異を導入したRBPの機能解析にも取り組んでいく。
|
